涂陽肺結(jié)核患者γ-干擾素釋放試驗假陰性的影響因素分析

馬進寶 馬婷婷 任斐 楊翰 譚淦紋

γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)是一種基于人體細胞免疫應答機制，在體外用早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)刺激結(jié)核分枝桿菌抗原致敏的效應記憶T細胞釋放相應的細胞因子，然后通過定量或定性分析系統(tǒng)檢測細胞因子的釋放含量變化情況，進而輔助診斷機體是否存在結(jié)核分枝桿菌感染的技術。相較結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)，IGRA具有檢測快速及不受卡介苗(BCG)接種和非結(jié)核分枝桿菌感染影響的優(yōu)勢[1]，其在輔助診斷結(jié)核病時有較高的敏感度和特異度[2-3]。但是IGRA的檢測結(jié)果可能受機體免疫力、疾病類型、T細胞功能的影響，從而出現(xiàn)假陰性。筆者通過對比IGRA檢測陽性及假陰性涂陽肺結(jié)核患者臨床資料，以期分析IGRA檢測假陰性的影響因素，為臨床判斷IGRA假陰性結(jié)果及輔助結(jié)核病診斷提供參考。

對象和方法

1.研究對象：搜集2019年6—12月就診于西安市胸科醫(yī)院的196例痰涂陽肺結(jié)核患者作為研究對象，其中，男145例(74.0%)，女51例(26.0%)；年齡中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]為38(26，53)歲。按IGRA檢測結(jié)果分為IGRA檢測陽性組(106例)和假陰性組(90例)。本研究經(jīng)西安市胸科醫(yī)院倫理委員會審批，研究對象入組前均對其進行了充分的知情宣講，并簽署知情同意書。

2.納入和排除標準：(1)納入標準：①痰涂片抗酸染色陽性；②影像學可見肺部病灶。(2)排除標準：①最終確診為非結(jié)核分枝桿菌病；②既往肺部基礎疾病；③并發(fā)腫瘤、自身免疫性疾病、HIV感染及免疫抑制劑使用者。

3.資料收集：所有患者收集其一般資料[性別、年齡、卡介苗接種史、結(jié)核病史、是否并發(fā)糖尿病、結(jié)核病病程、是否對一線抗結(jié)核藥品耐藥、痰菌載量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)]，臨床癥狀(發(fā)熱、咳嗽、咳痰、體質(zhì)量減輕)，實驗室檢驗資料[白細胞計數(shù)、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)、血清總蛋白含量、血清白蛋白含量、血腺苷脫氨酶水平、血紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)、總T淋巴細胞計數(shù)、CD4+T淋巴細胞計數(shù)、CD8+T淋巴細胞計數(shù)、CD4+/CD8+比值，以及胸部CT表現(xiàn)(病灶累及肺野范圍、肺部空洞數(shù))。

4.IGRA檢測：采用結(jié)核感染T細胞檢測試劑盒(購自北京萬泰公司)，該方法分體外抗原刺激全血培養(yǎng)釋放γ干擾素(INF-γ)和用 ELISA法定量測定INF-γ 兩步。采集研究對象靜脈血4 ml，分裝到背景管、檢測管和陽性管各1 ml，于37 ℃培養(yǎng)(22+2) h，2200×g離心10 min，取上清液用ELISA方法檢測，得到各管吸光度值(A值)，A值輸入配套軟件自動判讀結(jié)果。在獲得儀器結(jié)果時，觀察陽性管是否呈陽性反應，若陽性則表示試驗成功，若陰性則建議患者重新進行采樣檢測。在觀察背景管A值過高時，為排除操作不當引起的陽性管交叉污染等原因，同樣建議患者重新進行采樣檢測。

5.胸部CT掃描：采用美國GE公司Bright Speed Elite Select 16排CT機，受檢者取仰臥位，頭先進，于深吸氣末屏氣時自肺尖至肺底方向行全肺軸位平掃，層厚10 mm，層間距10 mm。由2位主治及以上職稱的影像學醫(yī)師對患者胸部CT表現(xiàn)進行判讀，判讀結(jié)果一致時記錄結(jié)果，不一致時由副主任醫(yī)師及以上職稱的影像學醫(yī)師一起商議決定。

結(jié) 果

1.單因素分析：196例研究對象中，IGRA檢測陽性106例，陽性率為54.1%。對IGRA檢測陽性組和假陰性組患者的一般資料、臨床癥狀、實驗室檢查、胸部CT表現(xiàn)等共29個指標進行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組研究對象的BMI、白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、血紅蛋白、血小板計數(shù)、血清白蛋白、ESR、CRP、CD4+T淋巴細胞計數(shù)等指標的差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

2.多因素分析：以IGRA陽性組及IGRA假陰性組為因變量，將BMI、白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、血紅蛋白、血小板計數(shù)、血清白蛋白、ESR、CRP、CD4+T淋巴細胞計數(shù)等進行多因素logistic回歸分析(變量賦值見表2)，結(jié)果顯示，白細胞計數(shù)≥7.0×109個/L、ESR≥40 mm/1 h、CD4+T淋巴細胞計數(shù)<400 個/μl是IGRA檢測假陰性的獨立危險因素，見表3。

表1 涂陽肺結(jié)核患者IGRA檢測假陰性影響因素的單因素分析

續(xù)表1

表2 涂陽肺結(jié)核患者IGRA檢測假陰性影響因素的多因素logistic回歸分析變量賦值

表3 涂陽肺結(jié)核患者IGRA檢測假陰性影響因素logistic回歸分析

討 論

確診結(jié)核病需找到結(jié)核分枝桿菌病原學依據(jù)，方法包括涂片抗酸染色、分枝桿菌培養(yǎng)、分子生物學方法等。臨床工作中有時因患者無痰或肺外結(jié)核限制了病原學依據(jù)的獲得，導致結(jié)核病確診困難。IGRA對潛伏結(jié)核感染(LITB)、活動性肺結(jié)核及疑似肺結(jié)核均有一定的診斷價值[4]，其通過血液標本進行檢測，不存在標本獲得困難問題，且IGRA檢測活動性肺結(jié)核有較高的敏感度(74.6%～84.8%)[2,5-6]。劉佳文等[7]研究發(fā)現(xiàn)，IGRA檢測菌陽肺結(jié)核的陽性率為74.1%。本研究中，IGRA檢測痰涂陽肺結(jié)核患者的陽性率為54.1%，低于上述研究，考慮可能與以下因素有關：(1)試劑盒的檢測性能及實驗人員的操作誤差引起；(2)國產(chǎn)試劑盒使用ELISA方法檢測全血INF-γ，因血液成分復雜影響因素較多，且與傳統(tǒng)的結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)相比，不能夠刺激定量的T淋巴細胞來檢測INF-γ釋放水平，因此，導致陽性率明顯低于T-SPOT.TB；(3)實驗室的規(guī)范化操作及日常的質(zhì)量控制是避免隨機誤差引起實驗假陰性的有效手段，但并不能完全排除此因素的影響。

本研究通過分析可能影響IGRA檢測假陰性的因素，發(fā)現(xiàn)白細胞計數(shù)升高、ESR升高、CD4+T淋巴細胞計數(shù)減少是IGRA檢測假陰性的獨立危險因素。INF-γ主要是由活化的T淋巴細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、樹突狀細胞等分泌[1]，其中，淋巴細胞和結(jié)核病的免疫有密切關系。Kwon等[8]通過多因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞計數(shù)低于1.0×109個/L是IGRA檢測假陰性的獨立危險因素。張娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB檢測陰性患者淋巴細胞計數(shù)低于陽性患者。本次研究中，單因素分析也獲得了相同結(jié)果。中性粒細胞在結(jié)核病固有免疫中發(fā)揮作用，其對結(jié)核病早期機體殺傷結(jié)核分枝桿菌及病情發(fā)展中免疫調(diào)節(jié)有重要作用[10]。中性粒細胞百分比升高可能預示結(jié)核病免疫尚處在固有免疫階段，非特異性免疫應答水平不高。白細胞計數(shù)升高時，中性粒細胞百分比升高，而淋巴細胞百分比降低，導致INF-γ生成減少，白細胞計數(shù)變化可能同時體現(xiàn)了淋巴細胞及中性粒細胞對IGRA的影響。

ESR與結(jié)核病活動性密切相關[11]，其結(jié)果能夠反映機體對結(jié)核病炎癥反應程度。吳純等[12]研究發(fā)現(xiàn)INF-γ釋放水平與ESR呈負相關，與本研究結(jié)果相似。關于ESR與INF-γ釋放水平研究較少。有研究顯示，CRP升高與IGRA檢測不確定性及假陰性結(jié)果相關[13-14]，提示患者高炎癥水平可能與IGRA檢測假陰性有關，本研究單因素分析顯示ESR和CRP升高與IGRA假陰性相關，與文獻結(jié)論一致。結(jié)核病機體免疫與T淋巴細胞密切相關，其中，以CD4+T淋巴細胞占主導[15]。既往研究CD4+T淋巴細胞與INF-γ釋放水平有關[16-17]，CD4+T淋巴細胞數(shù)目與功能降低將直接導致INF-γ釋放降低。另有研究表明，引起CD4+T淋巴細胞減少的臨床因素可能導致IGAR檢測假陰性，HIV感染者易并發(fā)結(jié)核分枝桿菌感染，HIV感染導致CD4+T淋巴細胞減少，HIV陽性的活動性肺結(jié)核患者應用IGRA檢測的陽性率下降[18-19]。老年患者因其CD4+T淋巴細胞功能及數(shù)量降低易導致IGRA檢測假陰性[13，20-21]。本次研究未能得出相應結(jié)論，可能與>65歲患者例數(shù)較少有關。因此，對于可能并發(fā)導致CD4+T淋巴細胞降低相關疾病的患者，當其IGRA檢測陰性時應小心漏診結(jié)核感染。

既往關于T-SPOT.TB檢測結(jié)果的影響因素研究較多，而關于IGRA-ELISA法檢測結(jié)果的影響因素研究較少，IGRA-ELISA法通過測定活化的T淋巴細胞釋放INF-γ的量來衡量是否有結(jié)核感染，其假陰性影響因素可能與T-SPOT.TB不同，本研究結(jié)果顯示白細胞計數(shù)升高、ESR升高、CD4+T淋巴細胞計數(shù)降低是IGRA檢測涂陽肺結(jié)核患者出現(xiàn)假陰性結(jié)果的危險因素，為臨床進一步判讀IGRA檢測結(jié)果提供了依據(jù)。本研究綜合納入患者一般資料、臨床癥狀、實驗室檢驗、影像學資料等進行多因素分析，更全面的納入了可能影響IGRA假陰性的因素。本研究不足之處在于納入分析因素多而納入研究患者數(shù)有限，可能影響多因素分析結(jié)果。并發(fā)HIV感染可能與IGRA檢測假陰性相關，因本地區(qū)HIV感染并發(fā)結(jié)核病的發(fā)病率低而未能納入分析。此外，本研究以痰涂陽肺結(jié)核患者為研究對象，不能完全確定為結(jié)核分枝桿菌感染，但鑒于已排除部分經(jīng)后續(xù)菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌感染的患者，且西部地區(qū)非結(jié)核分枝桿病發(fā)病率低等因素，考慮其對研究結(jié)果影響較小。