PCR擴增技術聯合CRISPR-Cas13a系統對MTB DNA檢測方法的初步研究

于佳佳 張旭霞 張雨晴 任衛聰 姚叢 李傳友 劉毅 唐神結

結核病是威脅人類生命健康的主要疾病，仍是全球十大死亡原因之一[1]。為實現2030年“終止結核病”的目標，早期、快速、準確的實驗室診斷是提高結核病發現率和減少傳播及發病的關鍵[2]。近年來，分子核酸檢測已成為實驗室診斷結核病廣泛應用的重要手段[3]，如GeneXpert MTB/RIF、線性探針、環介導等溫擴增(LAMP)、熒光聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)熔解曲線和基因芯片等檢測方法，但因存在試劑貴、成本高、設備特殊、過程繁瑣，以及檢測時間較長、準確度和特異度較低等問題[4]，難以在基層常規開展，迫切需要開發更快速、簡便、價廉的高敏感度和高特異度的新型檢測技術，以廣泛應用于基層結核病的早發現、早治療、早控制。

規律成簇間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系統是存在于細菌和古細菌中的獲得性免疫系統[5-6]，其中Cas13a(CRISPR-associated 13a)蛋白具有RNA酶的活性[7]，具有獨特的靶向和切割機制，可在規律成簇間隔短回文重復序列RNA(CRISPR RNA, crRNA)的引導下識別單鏈核糖核酸 (single-stranded ribonucleic acid, ssRNA)[8]，非特異性剪切非目標RNA[9-10]已被證明是一種高敏感度和高特異度的檢測方法[11-13]。本研究將已高度成熟的PCR擴增技術與CRISPR-Cas13a檢測技術相結合，通過對含MTB DNA的質粒模板、標準菌株H37Rv及6種非結核分枝桿菌進行敏感度及特異度分析，嘗試建立一種更敏感、更準確、更快速、更簡便的新型MTB核酸檢測方法。

材料和方法

一、研究材料

1.菌株與質粒載體：戈登分枝桿菌(M.gordonae)、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、膿腫分枝桿菌(M.abscessus)、鳥分枝桿菌(M.avium)、偶發分枝桿菌(M.fortui-tum)等6種非結核分枝桿菌，以及大腸埃希菌E.coli和MTB H37Rv(ATCC 25618)菌株采用本實驗室保存的菌株；質粒載體pMD19-Tsimple Vector 購自生工生物工程(上海)有限公司。

2.主要試劑：Cas13a蛋白由軍事醫學研究院微生物流行病研究所贈與；報告RNA試劑盒(RNase Alert v2, 30315288，Invitrogen公司)、鼠RNA酶抑制劑(Murine RNase inhibitor，M0314L，New England BioLabs公司)、T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase Mix，M0255A，New England BioLabs公司)、Ex Taq Version 2.0[TaKaRa, RR003，寶日醫生物技術(北京)有限公司]、RNA純化磁珠[Agencourt RNA Clean XP，Beckman Coulter，貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]、焦碳酸二乙酯處理的純水 [DEPC treated water，等同于無核酸酶水(nuclease-free water)]、[pyrogen-free，46-2224，生工生物工程(上海)有限公司]、透明96孔板(Gene Protein，OS0329，Applied Biosystems公司)、封膜(Sealing Film，F601418-0001，BIO-RAD公司)等。

3.主要儀器：FLUOR-CHEM E凝膠成像系統(ProteinSimple公司)、ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司)、DYY-3-4電泳儀(北京六一儀器廠)、Thermo Heraeus X1R臺式高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、Eppendorf Micro 21R冷凍型微量式離心機[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、哈東聯BSC-1360II A2生物安全柜(浙江衛康檢測科技有限責任公司)、HH.W21-Cr 420電熱恒溫水箱(北京長安永創科學儀器有限公司)、Axygen Maxygene-II梯度PCR儀(廣州科適特科學儀器有限公司)、梅特勒ME204電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)等。

二、研究方法

(一)構建模擬MTB質粒

將MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆載體，構建含待檢測靶序列的質粒[基因片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成](圖1)[14]，用于設計含IS6110保守序列的模擬MTB質粒，以驗證crRNA探針的有效性和特異性。

注 示意圖來源于文獻[14]。pMDTM19-Tsimple Vector：一種高效克隆PCR產物的專用載體；IS6110：MTB的保守序列。圖中可見將MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆載體，構建含待檢測靶序列的質粒圖1 構建含待檢測靶序列的質粒結構示意圖

(二)設計MTB crRNA探針序列及引物

1.擴增模板的確立：利用MTB的保守序列IS6110，設計包含重復序列和檢測靶點的規律成簇間隔短回文重復序列DNA(CRISPR DNA, crDNA)序列的擴增模板，所需序列及引物見表1。

2.crDNA的合成、產物回收：將設計的crDNA擴增模板及上下游引物加入至50 μl擴增體系中進行PCR擴增。回收擴增后的crDNA，用紫外分光光度計(nanodrop)測定不同濃度的相對熒光強度值，-80 ℃分裝備用。

3.crRNA探針的轉錄及分離：將擴增后的含crDNA的擴增體系充分混勻后，37 ℃轉錄過夜(轉錄體系見表2)，轉錄為實驗所需的3條不同的crRNA，即IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA，每條crRNA設置3個復孔，對構建成功的含有MTB DNA的質粒進行檢測，對3個復孔的檢測結果取均值(3個復孔每一次循環檢測的相對熒光強度數值結果相加除以3得到每一循環的結果，共60個循環)，比較3條不同crRNA信號的強弱，選擇相對熒光強度值最高的1條crRNA用于后續實驗檢測。具體序列見表3。

表1 用于檢測MTB DNA的crDNA序列及引物

表2 crDNA轉錄體系

表3 用于檢測MTB DNA的crRNA 序列

4.轉錄后crRNA的純化：提前將磁珠振蕩混勻，向轉錄產物中加入1.8倍體積的磁珠并渦旋30 s 以混勻磁珠和轉錄體系，室溫靜置3～5 min。再將反應體系置于磁力架上，靜置5～10 min輕輕吸出體系中的液體，以分離磁珠。再向磁珠中加入70%的乙醇200 μl，室溫孵育30 s，吸出乙醇；重復此過程清洗磁珠，共3次。室溫晾干體系，去除體系中的乙醇，約10 min。加入50 μl nuclease-free water(陰性對照)溶解體系中的crRNA，渦旋30 s，吸出上清液，放入1.5 ml離心管中， nanodrop測定純化得到的crRNA濃度的相對熒光強度值，-80 ℃分裝備用。

(三)建立PCR-CRISPR檢測方法和篩選crRNA序列

用特異性引物對待檢測標本(梯度稀釋的MTB質粒、H37Rv菌株及處理的非結核分枝桿菌)進行PCR擴增，再對得到的擴增序列進行瓊脂糖凝膠電泳[陰性對照(NC)無條帶時，說明擴增過程中無污染；將出現模糊條帶視為其檢測PCR產物敏感度的界值]，檢測擴增序列是否為實驗所需的靶序列。將特異性引物擴增的靶序列(ssRNA，100 ng)、T7聚合酶(1 μl)、Cas13a蛋白(45 nmol/L)、crRNA(22.5 nmol/L)、NTP Buffer Mix(2 μl)、Murine RNase inhibitor(2 μl)、Background RNA(100 ng)等加入到反應體系中，構建不同待檢測標本的PCR-CRISPR反應體系，并放入熒光定量PCR儀中檢測。設置激發光波長為490 nm、37 ℃反應15 s，發射光波長為520 nm、37 ℃反應45 s，FAM通道檢測相對熒光強度變化，共60個循環。儀器自動檢測及報告RNA相對熒光強度變化情況(取均值)。

(四) PCR-CRISPR方法對含有MTB IS6110片段質粒檢測的敏感度分析

將含有MTB IS6110片段的質粒進行梯度稀釋(106、105、104、103、102、101、100拷貝/μl)，每個模板取1 μl進行PCR 擴增，擴增后用T7聚合酶進行轉錄，收集純化轉錄產物，用上述建立的PCR-CRISPR方法上機檢測其相對熒光強度值，分析敏感度。

(五)PCR-CRISPR檢測方法對MTB 標準菌株H37Rv的檢測分析

將標準菌株H37Rv置于羅氏培養基37 ℃溫箱內進行固體擴大培養3周，刮取菌株并研磨分散以備下一步實驗用；測量處理后的菌株吸光度值(1個吸光度值相當于2×108CFU/ml)。對處理后的H37Rv菌株進行梯度稀釋，得到濃度為 106、105、104、103、102、101、100拷貝/μl的模板，進行PCR擴增，擴增后用T7聚合酶進行轉錄，收集純化轉錄產物，同樣按上述 PCR-CRISPR方法檢測相對熒光強度值，分析敏感度。

(六)PCR-CRISPR檢測方法對MTB DNA特異度分析

對戈登分枝桿菌、胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、偶發分枝桿菌等6種非結核分枝桿菌提取DNA后進行PCR擴增，使用PCR-CRISPR檢測其產物的相對熒光強度值，分析該方法的特異度。

三、統計學處理

利用SPSS 24.0軟件對數據進行統計學分析。采用GraphPad Prism 8.0.1(244) 繪制數據折線圖和柱狀圖。非正態分布的數據采用中位數(四分位數)[M(Q1,Q3)]進行統計描述，并采用獨立樣本秩和檢驗(Kruskal-Wallis)進行多組數據的比較，以P<0.05為差異有統計學意義。如果多組比較差異有統計學意義，則進行不同檢測組與對照組差異的兩兩比較,α′水平的調整采用Bonferroni校正，α′=0.05/7。

結 果

一、PCR-CRISPR檢測含有MTB IS6110片段的模擬質粒

將模擬MTB質粒按照106→100拷貝/μl進行梯度稀釋、PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，顯示無條帶的陰性對照，以及清晰可見的103～106拷貝/μl的MTB DNA模板的電泳條帶，且亮度隨濃度的升高而增加(圖2)。

注 M：marker相對分子質量梯度；NC：陰性對照；100～106：分別為質粒標準品100～106拷貝/μl的PCR擴增產物電泳結果圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測含有MTB IS6110片段的模擬質粒的擴增結果

二、IS6110-crRNA探針檢測能力的比較

對MTB保守序列IS6110進行分析后，將3條不同的crRNA(即IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA)與陰性對照分別對Cas13a 蛋白的特異性進行驗證。結果顯示，IS6110-3crRNA檢測的相對熒光強度值從第1個循環的29 186.40 上升至第60個循環的46 184.80，M(Q1,Q3)為38 504.44(33 343.34,42 848.99)，與陰性對照[38 794.06(38 509.60，39 076.07)]相近；而IS6110-1crRNA(從39 770.85上升至397 353.57)和IS6110-2crRNA(從46 709.64 上升至104 214.52)在識別目標核酸后均顯示出較強的熒光信號[相對熒光強度值分別為197 680.64(98 364.94,304 271.25)和82 600.00(67 014.09,94 379.19)]，分別約為陰性對照的10倍和3倍(圖3)。因此，選擇熒光信號最強的IS6110-1crRNA作為后續MTB DNA 檢測的crRNA。

注 NC：陰性對照圖3 3條不同crRNA探針檢測能力的比較

三、 PCR-CRISPR方法對含有MTB IS6110片段質粒的檢測

檢測結果顯示，106、105、104、103、102、101及100拷貝/μl質粒擴增產物的相對熒光強度值分別從第1個循環的22 203.66、22 087.28、19 740.01、22 632.79、30 592.57、28 511.19、21 262.39 上升至第60個循環的204 670.80、149 774.88、108 329.05、98 376.96、78 644.29、51 740.02、30 263.20，M(Q1,Q3)分別為113 272.44(68 467.39，159 309.84)、80 996.82(51 021.56，114 891.18)、61 000.13(39 817.42，83 940.77)、62 308.54(41 543.18，81 014.50)、50 154.71(36 952.00，64 654.68)、38 655.34(31 975.51，45 410.32)、28 739.11(25 216.65，32 359.91)，與陰性對照[29 989.48(29 435.72，30 263.20)]總體比較差異有統計學意義(χ2=258.400,P<0.001)(圖4，5)，且發現隨著模板稀釋濃度的升高，不同濃度質粒模板的相對熒光強度增強；進一步進行兩兩比較，顯示前6組質粒擴增產物的相對熒光強度值均明顯高于陰性對照(Z=-8.503、-8.188、-6.986、-7.857、-9.369、-6.713，P值均<0.001)，僅100拷貝/μl質粒擴增產物的數值與陰性對照差異無統計學意義(Z=-1.627，P=0.104)。

注 NC：陰性對照；100～106分別為質粒標準品100～106拷貝/μl的PCR擴增產物；NS：差異無統計學意義；***：P<0.001圖4、5 分別為PCR-CRISPR檢測MTB DNA質粒標準品敏感度的折線圖和柱狀圖

四、 PCR-CRISPR檢測標準菌株H37Rv的敏感度

利用MTB標準菌株H37Rv進一步評估PCR-CRISPR檢測方法的敏感度。電泳結果可見無條帶的陰性對照，以及清晰可見的104～106拷貝/μl的H37Rv標準品模板電泳條帶，而103拷貝/μl時僅能觀察到模糊的條帶(圖6)。

隨后再利用梯度稀釋的H37Rv標準品對PCR-

注 M：marker相對分子質量梯度；NC：陰性對照；100～106分別為標準菌株H37Rv稀釋濃度100～106拷貝/μl的PCR擴增產物電泳結果圖6 瓊脂糖凝膠電泳檢測H37Rv的擴增結果

注 NC：陰性對照；100～106分別為標準菌株H37Rv稀釋濃度100～106拷貝/μl的PCR擴增產物；***：P<0.001圖7、8 分別為PCR-CRISPR檢測標準菌株H37Rv敏感度的折線圖和柱狀圖

CRISPR檢測方法進行評估。106、105、104、103、102、101及100拷貝/μl的H37Rv擴增產物的相對熒光強度值變化分別從第1個循環的26 351.51、24 139.54、14 191.19、16 998.90、18 593.55、17 513.12、17 498.48 上升至第60個循環的89 488.21、82 411.36、63 195.01、65 233.19、41 911.39、45 363.23、18 016.47，M(Q1，Q3)分別為68 115.15(49 224.36，80 863.30)、63 205.56(45 458.62，74 907.73)、41 007.78(25 503.90，53 859.83)、37 679.07(23 630.95，52 455.66)、27 503.72(21 049.85，34 784.11)、27 571.79(20 219.58，36 395.17)、17 691.50(17 612.36，17 793.29)，與陰性對照[13 725.83(13 652.43，13 804.95)]總體比較差異有統計學意義(χ2=345.600,P<0.001)；且發現隨著H37Rv模板濃度的升高，不同濃度H37Rv模板的熒光強度增強(圖7,8)。進一步進行兩兩比較，顯示上述7組的相對熒光強度值均明顯高于陰性對照(Z值均=-9.448；P值均<0.001)。

五、PCR-CRISPR檢測MTB DNA的特異度

利用6種非結核分枝桿菌評估PCR-CRISPR檢測方法的特異度。電泳結果可見無條帶的陰性對照、6種非結核分枝桿菌電泳結果，以及清晰可見的106拷貝/μl的MTB DNA質粒的電泳條帶(圖9)。

注 M：marker相對分子質量梯度；NC：陰性對照；106：為質粒標準品106拷貝/μl的PCR擴增產物電泳結果；1：戈登分枝桿菌；2：胞內分枝桿菌；3：堪薩斯分枝桿菌；4：膿腫分枝桿菌；5：鳥分枝桿菌；6：偶發分枝桿菌圖9 瓊脂糖凝膠電泳檢測6種非結核分枝桿菌及106拷貝的MTB DNA質粒的擴增結果

注 NC：陰性對照；106：質粒標準品106拷貝/μl的PCR擴增產物；***：P<0.001圖10、11 分別為PCR-CRISPR檢測6種非結核分枝桿菌及106拷貝MTB DNA質粒特異度的折線圖和柱狀圖

隨后利用陰性對照、6種非結核分枝桿菌及106拷貝/μl MTB DNA質粒標準品對PCR-CRISPR方法進行檢測，結果可見，陰性對照 [37 635.57(37 168.74，38 199.20)]、戈登分枝桿菌[39 351.83(38 903.70，39 769.53)]、胞內分枝桿菌[39 191.30(39 018.51，39 434.95)]、堪薩斯分枝桿菌[25 172.20(24 586.95，26 046.45)]、膿腫分枝桿菌[37 328.03(36 959.01，37 546.78)]、鳥分枝桿菌[37 942.29(37 455.63，38 401.13)]、偶發分枝桿菌[29 491.19(29 148.63，30 058.62)]等6種非結核分枝桿菌的相對熒光強度值與106拷貝/μl的MTB DNA質粒的數值[從第1個循環的46 859.64上升至第60個循環的124 344.52，M(Q1,Q3)為89 204.07(66 253.60，108 819.13)]總體比較差異有統計學意義(χ2=441.900，P<0.001)；進一步進行兩兩比較，顯示7組相對熒光強度值均明顯高于陰性對照(Z值均=-9.448，P值均<0.001)(圖10,11)。特異度良好。

討 論

結核病是引起人類死亡的重大傳染性疾病，我國目前結核病疫情仍然十分嚴峻[1]。將PCR擴增和CRISPR-Cas13a檢測技術相結合建立一種高敏感度、高特異度的核酸檢測方法，對結核病的早期及準確診斷具有積極意義，為開發體外核酸檢測的高敏感度診斷工具提供了新思路，同時也為PCR-CRISPR檢測技術應用于臨床標本檢測提供了重要的理論依據。

CRISPR檢測方法在病毒檢測中的開發較多，在細菌中開發較少。目前，Gootenberg等[13]建立了高敏感度和高特異度的SHERLOCK核酸檢測方法，并將之應用于生物樣本(血液或尿液)中多種病毒的檢測；East-Seletsky等[12]利用CRISPR-Cas13a系統對10 pmol/L 的RNA分子進行檢測。Ai等[15]開發了一種基于CRISPR-Cas12a的MTB快速檢測方法——CRISPR-MTB，并對179例患者進行回顧性隊列研究，發現CRISPR-MTB(79%)相較于培養(33%)和GeneXpert MTB/RIF(66%)顯示出更高的敏感度；且在不同類型的樣本中，CRISPR-MTB相較于培養和GeneXpert MTB/RIF具有更強的整體診斷性能，為肺結核及肺外結核新的診斷技術提供了巨大的潛力；其中Cas12a可將識別的雙鏈DNA (double-stranded DNA，dsDNA)作為激活劑，并可切割單鏈DNA (single-stranded DNA，ssDNA)；但與靶向DNA的CRISPR相關酶(如Cas9a和Cas12a)不同，Cas13a能夠在切割靶RNA之后保持活性，并且可在一系列被稱作“附帶切割(collateral cleavage)”的作用中繼續切割其他的非靶向RNA。另外，CRISPR-Cas13a檢測技術也在寨卡和登革熱[16]、EBV[17]、埃博拉[18]、SARS-CoV-2[19]等病毒中顯示出較高的敏感度，提示Cas13a能夠被用來實現較高敏感度的檢測，可廣泛應用于科學和臨床醫學領域。

本研究利用PCR技術穩定性好、實用性強及高效擴增靶序列的特點，建立了基于PCR和CRISPR-Cas13a系統的MTB DNA檢測方法——PCR-CRISPR。本檢測方法首先設計含IS6110保守序列的質粒，將MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆載體，構建含待檢測靶序列質粒，隨后篩選出1條可用于MTB檢測的crRNA，以模擬MTB質粒驗證crRNA探針的有效性和特異性。然后利用PCR-CRISPR檢測方法應用于MTB擴增、轉錄、crRNA 識別和 Cas13a 剪切等一系列特定過程，將擴增后的目標核酸進一步放大。該檢測技術所應用的Cas13a蛋白是RNA引導下的靶向單蛋白效應器，具有獨特的RNA靶向機制，是將獨特的crRNA與靶點ssRNA相結合以引起Cas13a 構象變化，從而激活Cas13a強大的“平行切割效應”，使得Cas13a高效地剪切體系中的報告RNA，釋放熒光信號，通過檢測報告RNA釋放的相對熒光強度來判斷體系中是否存在靶序列。但需要注意的是，只有擴增產物轉錄為相應的ssRNA時，后續才能進行相應的crRNA識別及Cas13a激活等過程?；诖?，即使對于低濃度的MTB DNA，也可檢測到明顯高于陰性對照的熒光信號，檢測出體系中目標核酸的存在。

本研究顯示，PCR-CRISPR檢測MTB模擬質?；騂37Rv菌液的相對熒光強度值與陰性對照，以及陰性對照和6種非結核分枝桿菌與106拷貝/μl質粒標準品的相對熒光強度值的差異均有統計學意義，提示該方法敏感度及特異度良好，可檢測待測樣本是否感染或含有MTB。本研究利用PCR-CRISPR檢測方法檢測不同濃度質粒模板和標準菌株H37Rv的敏感度，結果顯示在拷貝數101拷貝/μl和100拷貝/μl就可以達到較好的敏感度。再通過檢測6種非結核分枝桿菌評估PCR-CRISPR檢測方法的特異度，結果顯示PCR-CRISPR同時具有較好的特異度。本研究建立了新的檢測方法和系統，并進一步驗證了該檢測方法在檢測MTB中的可行性和可靠性，下一步將利用PCR-CRISPR檢測方法對臨床菌株或患者進行驗證評估。基于等溫擴增技術開發的PCR-CRISPR檢測技術，因其核酸檢測功能具有可擴展性和高度復用能力，可將診斷和監測工作從樣本的定向檢測轉移到大樣本集的綜合檢測，有望在全球大部分地區實施，實現對感染性疾病的快速診斷。

綜上所述，基于PCR擴增和CRISPR-Cas13a系統，本研究首次建立了針對MTB DNA的PCR-CRISPR核酸檢測技術，具有敏感度高、特異度強、穩定性好及實用性強等特點，且成本更低，有望在臨床檢測實踐中廣泛推廣。

志謝本研究統計學處理由首都醫科大學附屬北京胸科醫院流行病統計學室康萬里研究員指導！