青海省南部地區154株結核分枝桿菌臨床分離株耐藥性檢測結果分析

蔣明霞 晁秀珍 王兆芬 馬斌忠 馬永成 王蓉 王朝才 李爾琛 魏於家 李詠雪 張琪

據2018年世界衛生組織報告， 2017年全球新發結核病患者估算約1000萬例，耐多藥和(或)單耐利福平結核病(MDR/RR-TB)患者56萬例。中國新發結核病患者約90萬例，MDR/RR-TB患者7.3萬例[1]。耐藥結核病的出現增大了治療難度，全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，我國結核病患病率呈現西部高于中部、中部高于東部的特征，結核病總耐藥率為36.8%，耐多藥結核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)占6.8%[2]。青海省平均海拔3000米以上，南部(以下簡稱“青南地區”)平均海拔超過4000米，面積占全省總面積的一半以上，氣溫偏低，以藏族、蒙古族為主要民族，以農、牧業為主。為掌握青南高寒地區結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)耐藥類型及分布情況，為改進牧業區結核病防治措施提供依據，筆者對我省結核病參比實驗室收集的154株MTB進行耐藥性分析。

資料和方法

一、 菌株來源

1.菌株的選?。菏占嗄系貐^(玉樹州、果洛州、黃南州)市/州級疾病預防控制中心結核病實驗室2018—2019年全部518例病原學陽性患者的標本，進行分離培養，并對培養陽性菌株進行抗結核藥物敏感性試驗和菌種鑒定，最終經菌種鑒定的MTB菌株為154株。其中，玉樹州44株、果洛州12株、黃南州98株；男性95株，女性59株；年齡分布在13～79歲之間，中位年齡27歲。

2.菌株分離：依據《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[3]，應用改良羅氏培養基進行痰分枝桿菌分離培養。痰標本采用4% NaOH去污染處理后直接接種至酸性羅氏固體培養基上，接種后第3天和第7天觀察培養情況，然后每周觀察1次，直到第8周末。

3.菌種鑒定：分離株在進行藥物敏感性試驗的同時，利用對硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)培養基生長試驗初步鑒別結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌，排除非結核分枝桿菌。

二、 研究方法

1.主要試劑：改良羅氏培養基、藥物敏感性試驗培養基、PNB培養基均購自珠海貝索生物技術有限公司。

2.藥物敏感性試驗：藥物敏感性試驗操作參考《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》[4]中的比例法，對異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、鏈霉素(streptomycin，Sm)、卡那霉素(kanamycin，Km)、氧氟沙星(ofloxacin，Ofx)6種抗結核藥品進行敏感性測定。結果判斷標準：含藥培養基與對照培養基表面菌落數之比≥0.01判斷為耐藥。

三、質量控制

每批試驗均以MTB標準株H37Rv作為對照。省級結核病參比實驗室人員和市/州級結核病實驗室人員每年均參加國家結核病參比實驗室組織的全國抗結核藥物敏感性試驗熟練度測試并獲得優秀和合格證書，保證實驗室檢測的標準性和質量。

四、耐藥結核病評判標準

單耐藥結核病(mono-resistant tuberculosis, MR-TB)、多耐藥結核病(poly-resistant tuberculosis, PR-TB)、MDR-TB、準廣泛耐藥結核病(pre-extensively drug-resistant tuberculosis, Pre-XDR-TB)、廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)、利福平耐藥結核病(rifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB)6種耐藥類型,參考中國防癆協會《耐藥結核病化學治療指南(2019年簡版)》[1]的概念。

五、統計學處理

應用Excel 2010軟件建立數據庫，采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行統計分析，計數資料采用“率 (%)”表示,以χ2檢驗對組間差異進行比較,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 不同地區耐藥類型與耐藥率

154株MTB菌株中全敏感菌株97株，耐藥菌株57株，總耐藥率為37.01%(57/154)，單耐藥率為23.38%(36/154),多耐藥率為3.25%(5/154), 耐多藥率為10.39%(16/154)，利福平耐藥率為18.18%(28/154)，廣泛耐藥率為0.00%。不同地區總耐藥率、單耐藥率、多耐藥率、耐多藥率、利福平耐藥率的比較，差異均有統計學意義(χ2=7.21、72.00、5.00、22.49、27.15，P值均<0.05)，3個地區均為黃南州的耐藥率高于玉樹州和果洛州。見表1。

二、 初、復治耐藥類型與耐藥率

初、復治患者總耐藥率相比，復治患者明顯高于初治患者。復治患者的總耐藥率、單耐藥率、耐多藥率、利福平耐藥率明顯高于初治患者，差異均有統計學意義(χ2=123.00、28.12、11.68、24.07，P值均<0.05)，復治患者的多耐藥率與初治患者多耐藥率差異無統計學意義(χ2=5.00，P>0.05)。見表2。

三、 任何耐藥率情況

6種抗結核藥品的任何耐藥率為69.48%(107/154)，由高到低依次為：異煙肼(24.68%,38/154)>利福平(18.18%,28/154)>鏈霉素(11.04%,17/154)>氧氟沙星(8.44%,13/154)>乙胺丁醇(5.84%,9/154)>卡那霉素(1.30%,2/154)。

四、 不同社會學特征患者耐藥情況分析

154例患者的性別(χ2=57.00，P<0.01)、年齡(χ2=118.51，P<0.01)、民族(χ2=288.37，P<0.01)和職業(χ2=371.17，P<0.01)的總耐藥率差異均有統計學意義。見表3。

討 論

在全球30個結核病高負擔國家中,中國的結核病死亡率為2.6/10萬，結核病死亡率排在30個高負擔國家中的第29位，僅高于巴西[6]。耐藥結核病，尤其MDR-TB是全世界面臨的巨大挑戰，MDR-TB治愈率低，約為50%[7-8]，病死率卻高達52%[9]。據2010年全國結核病流行病學抽樣調查顯示，西部地區結核病疫情嚴重，患病率高達695/10萬，高于全國平均水平[2]。2009—2012年青海省在農、牧民中發現活動性肺結核患者10 393例，占全部活動性肺結核患者總數的73.62%，提示農牧區的活動性、涂陽和菌陽肺結核患病率高于城鎮[10]。

表1 青南地區MTB臨床分離菌株的耐藥類型分布[耐藥株數(耐藥率，%)]

表2 初、復治患者MTB臨床分離株的耐藥類型分布[耐藥株數(耐藥率，%)]

表3 不同社會人口學特征患者耐藥情況分布[耐藥株數(耐藥率，%)]

本研究結果顯示，青南地區結核病患者總耐藥率為37.01%，耐多藥率為10.39%；復治患者總耐藥率為64.52%，復治患者耐多藥率為35.48%，分別高于全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果(36.8%、6.8%；35.9%、15.4%)[2]。總耐多藥率為10.39%，復治患者耐多藥率為35.48%，初治患者耐多藥率為4.07%；復治患者耐多藥率遠高于全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果，初治患者耐多藥率略低于全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果(分別為15.4%、5.4%)[2]。復治患者耐多藥率遠高于初治患者，原因可能一方面與長期服用以異煙肼和利福平為主要方案的抗結核藥品有關，增加了MTB耐藥性的產生。另一方面可能因為處于偏遠地區，經濟條件相對比較落后，很多農牧民族在發現得了結核病后在藥店自行購買藥品，癥狀有所緩解后便停藥，服藥很不規范; 當知道結核病的免費政策后到疾病預防控制中心(或定點醫院)就診，也不能按時服藥，造成大量耐藥患者的發生[11]。因此，筆者認為對青南地區應該進一步加強耐藥結核病患者的歸口管理，規范合理臨床用藥，控制耐藥性的關鍵環節。

利福平耐藥涵蓋所有對利福平耐藥的情況，包括單耐藥、耐多藥、多耐藥和廣泛耐藥[12]。2007—2018年的研究結果顯示，初治患者利福平耐藥率為6.6%，復治患者利福平耐藥率為30.0%；2013年初治患者利福平耐藥率為7.1%，復治患者利福平耐藥率為24.0%；高于全球初治和復治患者利福平耐藥率(3.6%、17.0%)[13]。本次研究結果顯示利福平耐藥率為18.18%，其中初治患者為13.01%，復治患者為38.71%，高于2007—2018年和2013年兩次全國耐藥基線調查結果，提示該地區利福平耐藥結核病疫情非常嚴重。楊儀等[14]認為，利福平耐藥會明顯降低一線抗結核藥品的療效，同時MTB也會很快發展為對異煙肼耐藥，成為MDR-TB。據WHO 2019年全球結核病報告，2018年全球估計約有48.4萬例新發利福平耐藥結核病患者，而這些患者中有78%為MDR-TB。在MDR-TB患者中，有6.2%估計為XDR-TB。有3個國家占了全球50%的MDR/RR-TB患者，分別為印度(27%)、中國(14%)和俄羅斯(9%)[6]。所以在今后的工作中更應該重視利福平耐藥結核病的實驗室診斷，加大政府投入，規范、合理臨床用藥，早發現、早診療，有效阻止MDR/RR-TB的傳播。

本研究結果顯示，異煙肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星的任何耐藥率分別為24.68%、18.18%、5.84%、8.44%，均高于2013年全國耐藥監測結核病患者單耐藥譜構成比(14.69%、9.55%、3.5%、6.2%)[13]。提示青南地區MDR/RR-TB疫情較為嚴重。

本次研究結果顯示，性別、年齡、民族、職業等人群特征總耐藥率差異均有統計學意義。耐藥MTB流行因素多而復雜，居住地為農村、文化程度為初中及以下、當地醫療水平、患者家庭收入、治療不規范、年齡、性別等均是MTB產生耐藥性的危險因素[15-17]；男性總耐藥率高可能與抽煙、不良生活習慣等有關；本次研究顯示中青年組(<45及45～60歲)總耐藥率高，與陳燕梅等[18]的研究結果相近。原因可能與中青年為家庭中的主要經濟來源，生活、工作壓力大，出入環境復雜，生活不規律造成免疫力下降而成為高危人群。藏族、蒙古族總耐藥率高，一方面是本次樣本收集人群主要以藏族為主，另一方面與該民族長期居住在帳房的生活習慣相關，為便于保暖，帳房通風較差，造成空氣不能流通，易造成呼吸道疾病的傳播。學生總耐藥率高，可能與生活環境及飲食有關。學生發病主要在牧區，學校以寄宿制為主，群體較為聚集。另外，青少年處于生長階段，而寄宿制學校的食堂能否滿足學生生長所需的營養需進一步了解，如此環境易患結核病[19]。另外，可能與學校結核病防控工作不完善有關。梁軍和文國穎[20]對青海農牧區居民的結核病防治行為傾向調查顯示: 如果有類似肺結核的癥狀，約40.00%的人選擇不就醫，高達10.00%的人表示不知道如何處理。農牧民對結核病防治知識認識不足、就醫不及時、患者自行買藥或不按照抗結核治療規則服藥，這些因素都極易導致抗結核治療失敗，并有可能產生耐藥性。由于本次樣本量較小，對人群特征耐藥類型未作進一步統計學分析。

本研究廣泛耐藥率可能比實際情況略低，因為二線抗結核藥品在本次試驗中只選擇Ofx和Km兩種，MDR-TB還可能對其他未測二線抗結核藥品耐藥，而使XDR-TB未檢測出,造成其比率可能比實際低。

綜上所述，青海南部地區MTB對6種常用抗結核藥品的耐藥率較高，應加強對中青年、學校、農牧民等重點人群耐藥性監測與治療，強化農牧區工作，進一步落實農牧民等重點人群薄弱環節的結核病防治措施[21]，早發現、早診斷、早治療，減少耐藥的產生。