螺旋藻渣營養成分分析及其發酵產物功能活性評價

付云，龐一揚，趙謀明，2，劉小玲，*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510000）

螺旋藻是工業化規模養殖的微藻之一[1]，其蛋白質含量豐富，氨基酸種類齊全，被譽為天然食物之冠[2]。螺旋藻渣是工業上螺旋藻粉生產過程中的沉積物。廣西北部灣是螺旋藻粉的重要生產基地，每年大量的螺旋藻渣被以污水排放的形式進行處理，小部分作為水產飼料低價銷售[3]，這導致螺旋藻渣資源不僅沒有被充分利用，反而成為了螺旋藻生產企業的經濟負擔，然而目前關于螺旋藻渣資源的回收利用相關的研究卻鮮有報道。因此，螺旋藻渣資源開發應用不僅可以提高螺旋藻的經濟價值，降低企業生產成本，同時也為廢棄蛋白質資源的開發利用提供了一條新途徑。

本研究以廣西北部灣螺旋藻渣為原材料，分析螺旋藻渣的基本營養組成、常量元素和重金屬含量，評價螺旋藻渣的可利用性，然后以5種不同來源益生菌對其進行液態發酵，評價螺旋藻渣發酵產物的抗氧化、降血脂及抑菌等功能活性，為科學合理開發利用螺旋藻渣提供技術支撐，同時，也為后續研究螺旋藻渣發酵產物中功能活性物質的種類及機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

供試菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CGMCC14519）、大腸桿菌（Escherichia coli CGMCC-112252）、沙門氏菌（Salmonella typhimurium CGMCC-11190）、志賀氏菌（Shigella flexneri CGMCC110599）：中國普通微生物菌種保藏管理中心；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis YA215）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis YA269）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus YA184）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus YB177）：課題組研究人員從北部灣海洋中分離并保存；羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri LT906）：輕工與食品工程學院613實驗室篩選；酵母菌（Arxula adeninivorans NBRC10858）：日本生物資源中心。

1.1.2 培養基

螺旋藻渣培養基（g/L）：螺旋藻渣15 g、果糖10 g、NaCl 10 g。制備固體培養基時添加2%瓊脂粉，調節pH值至7.0，121℃高壓滅菌20 min。

LB培養基（g/L）提供：蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g。制備固體培養基時添加2%瓊脂粉，調節pH值至7.0，121℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 試劑

螺旋藻渣：廣西生巴達生物科技有限公司（冷鏈運輸后快速凍結放于-20℃備用）。

氫氧化鈉、氯化鈉、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銅均為分析純：成都金山化學試劑有限公司；DPPH、ABTS、牛磺膽酸鈉、膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、福林酚、果糖：北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

UV-6100紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；CR21N高速冷凍離心機、L-8900全自動氨基酸分析儀：日立公司；SUNRISE酶標儀：帝肯（上海）貿易有限公司；ZQZY-85CS振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；SQP電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；GI80TW高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；SKD-800自動凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；SZF-06A自動脂肪測定儀：上海新嘉電子有限公司；SX-2-2.5-10馬弗爐：余姚金電儀表有限公司；Agilent 7700e電感耦合等離子體質譜儀：安捷倫科技有限公司（日本）。

1.3 方法

1.3.1 主要營養成分測定

水分含量：105℃恒溫烘干法參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》；蛋白質含量：GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》；灰分含量：GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》；脂肪含量：GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；總糖含量：GB/T 9695.31-2008《肉制品總糖含量的測定》。

1.3.2 常量元素和重金屬含量的測定

常量元素、砷、鉛、鉻、鎘及甲基汞的測定均采用電感耦合等離子體發射譜法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-OES），對應的國家標準分別為DBS52/019-2016《食品安全地方標準食品中鉀、鎂、鈣、鐵、鋅、磷、銅、鈉的測定》、GB 5009.11-2014《食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定》、GB 5009.12-2017《食品安全國家標準食品中鉛的測定》、GB 5009.123-2014《食品安全國家標準食品中鉻的測定》、GB 5009.15-2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》和GB 5009.17-2014《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》。

1.3.3 總氨基酸測定

稱取螺旋藻渣樣品5.00 g，根據GB 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》使用氨基酸自動分析儀進行氨基酸測定。

1.3.4 螺旋藻發酵產物的制備

將活化后的Bacillus subtilis YA215、Bacillus licheniformisYA269、LactobacillusbulgaricusYB177、Lactobacillus reuteri LT906和Arxula adeninivorans NBRC10858（5種菌懸液濃度均為108CFU/mL）分別接種于螺旋藻渣液體培養基中，200 r/min、37℃搖床培養24 h，8 000 r/min離心20 min，分別收集發酵上清液，冷凍干燥。

1.3.5 可溶性蛋白含量測定

參照LOWRY OH等[4]和林智等[5]的方法并稍作修改，將5種菌株發酵螺旋藻渣的凍干產物分別復溶于超純水，使其終濃度均為50 mg/mL，采用福林酚法測定發酵產物中可溶性蛋白含量，空白對照為未進行發酵的螺旋藻渣液體培養基凍干產物。

1.3.6 多肽含量測定

參照魯偉等[6]的方法并稍作修改，將5種菌株發酵螺旋藻渣的凍干產物分別復溶于超純水，使其終濃度均為50 mg/mL，然后各取2 mL，加入10%三氯乙酸2.0 mL，混勻，靜置 10 min，5 000 r/min 離心 15 min，取0.5 mL上清液于另一試管中，再加入2 mL雙縮脲試劑，混勻后靜置15 min，3 000 r/min離心15 min后，取上清液于540 nm處測吸光度值，以加0.5 mL蒸餾水和2.0 mL雙縮脲試劑作空白。

1.3.7 體外抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照邱現創等[7]和Bartolome等[8]的方法并稍作修改。稱取1.0 mg的DPPH自由基，以95%乙醇為溶劑，配制濃度為0.127 mmol/L的DPPH自由基溶液，保存于4℃冰箱中，備用。在2 mL 0.127 mmol/L DPPH自由基溶液中加入1 mL 50 mg/mL的發酵凍干產物樣品溶液，搖勻，室溫25℃下靜置30 min，517 nm下測定其吸光值AI；同時測定2 mL 0.127 mmol/L DPPH自由基溶于1 mL的95%乙醇混合液的吸光值AC；空白組為3 mL 50 mg/mL的發酵凍干產物樣品溶液517 nm下吸光度A0，陽性對照為20 mg/mL抗壞血酸VC。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為陰性對照組，樣品本身的吸光度值；AC為空白對照組，不加樣品時的吸光度值；AI為樣品組，加入樣品時的吸光度值。

1.3.7.2 ABTS+自由基清除能力的測定

參照 Dai Chunhua等[9]和Queiroz Santos Vidiany A等[10]的方法并稍作修改。將0.2 mL 7.4 mmol/L ABTS溶液與0.2 mL 2.6 mmol/L K2S2O8混合后室溫25℃下避光靜置12 h，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋 40～50倍，使其 OD734nm達到0.7左右，得到ABTS工作液。然后將3 mL ABTS工作液與200 μL 50 mg/mL的發酵凍干產物樣品溶液混合，充分搖勻，靜置6 min，734 nm處測定吸光值?？瞻讓φ諡镻BS緩沖液，陽性對照為20 mg/mL水溶性維生素E。ABTS+自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為空白對照在734 nm處的OD值；A1為樣品溶液在734 nm處的OD值。

1.3.8 體外降血脂活性測定

1.3.8.1 3種膽酸鹽標準曲線的繪制

參考曾橋等[11]和錢雅雯等[12]的方法并稍作修改，以pH 6.3、0.1 mol/L磷酸緩沖液配制0.3 mmol/L膽酸鈉、0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉和0.5 mmol/L?；悄懰徕c溶液，分別取 3 種膽酸鹽溶液 0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL具塞試管中，用0.1 mol/L，pH 6.3的磷酸緩沖溶液將膽酸鹽溶液定容至2.5 mL，然后加入7.5 mL質量分數60%的硫酸溶液，將混合溶液70℃水浴20 min，取出后冰浴冷卻至室溫25℃，374 nm處測吸光值，繪制3種膽酸鹽的標準曲線。經處理得到牛黃膽酸鈉、甘膽酸鈉、膽酸鈉的線性回歸方程分別為：y=15.849x+0.690 1，R2=0.999 3；y=39.856x+0.046 1，R2=0.994 7；y=39.162x+0.142 6，R2=0.993 1。

1.3.8.2 膽酸鹽結合試驗

參照于美匯等[13]的方法，分別移取3 mL 50 mg/mL不同發酵凍干產物樣品溶液各3份于100 mL三角瓶中，每個三角瓶分別加入3 mL 10 mg/mL胃蛋白酶溶液和1 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，37℃恒溫振蕩反應1 h（模擬胃消化環境），0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH值至6.3。隨后加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃下恒溫振蕩反應1 h（模擬腸道環境）。一份樣品中加入4 mL 0.3 mmol/L甘氨膽酸鈉；一份樣品中加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉；另一份樣品中加入4 mL 0.5 mmol/L牛磺膽酸鈉。37℃恒溫振蕩反應1 h，于4 000 r/min離心20 min，取上清液，用比色法于387 nm處測定吸光度值，每個樣品平行測定3次。以10 mg/mL考來烯胺作為陽性對照，按照標準曲線計算剩余甘氨膽酸鹽和牛磺膽酸鹽含量，所加入膽酸鈉或甘氨膽酸鈉或?；悄懰徕c總量減去剩余量所得差值與總量的比值即為結合率，以百分比表示。計算公式如下：

式中：c0為膽酸鈉加入量，μmol；c1為膽酸鈉剩余量，μmol。

式中：c2為甘氨膽酸鈉加入量，μmol；c3為甘氨膽酸鈉剩余量，μmol。

式中：c4為牛磺膽酸鈉加入量，μmol；c5為牛磺膽酸鈉剩余量，μmol。

1.3.9 抑菌活性測定

1.3.9.1 指示菌菌懸液的制備

將保存于-80℃冰箱內的5種指示菌（Staphylococcus aureus CGMCC14519、Escherichia coli CGMCC-112252、Salmonella typhimurium CGMCC11190、Shigella flexneri CGMCC110599和Bacillus cereus YA184）菌種接種于LB固體培養基中，37℃恒溫培養24 h。再將活化好的菌種挑單菌落，接種于100 mL LB液體培養基中，200 r/min、37℃搖床培養24 h，此時指示菌菌懸液濃度為107CFU/mL～108CFU/mL。

1.3.9.2 抑菌率測定

吸取100μL指示菌菌懸液于100mLLB培養液中，試驗組添加10mL50mg/mL不同發酵凍干產物樣品溶液，空白組不添加發酵凍干產物樣品溶液，進行抑菌試驗。培養12 h后，測定菌液在600 nm波長下吸光度值。通過試驗組與空白組的菌液濃度計算出抑菌率[14-15]。

式中：A1為空白組吸光度值；A2為試驗組吸光度值。

1.4 數據統計與分析

所有試驗均進行3次平行試驗，試驗數據均采用IBM SPSS Statistics 19與Origin 9.1進行數據分析，以平均值±標準差的形式呈現。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻渣組成成分分析

螺旋藻渣中主要成分含量見表1。

表1 螺旋藻渣中主要成分含量（干基）Table 1 Contents of the basic components in spirulina residue（dry basis）

螺旋藻渣主要營養成分含量如表1所示，螺旋藻渣中水分含量為6.28%，灰分含量為7.41%，脂肪含量為4.39%，粗蛋白含量達48.08%，總糖含量為5.37%，色素類物質含量為28.47%。董育紅等[16]曾報道指出螺旋藻中水分含量為4.50%，灰分含量6.20%，粗蛋白含量為69.30%，脂肪含量5.36%，總糖含量10.44%。雖然螺旋藻渣營養成分中蛋白質含量、脂肪含量和總糖含量低于螺旋藻本身，但它依然是一種蛋白質含量較高的低值副產物原料，具有一定的利用價值。

2.2 螺旋藻渣元素含量分析

螺旋藻渣中常量元素含量見表2，螺旋藻渣中重金屬含量見表3。

表2 螺旋藻渣中常量元素含量（干基）Table 2 Contents of major elements in spirulina residue（dry basis）

表3 螺旋藻渣中重金屬含量（干基）Table 3 Contents of heavy metal in spirulina residue（dry basis）

螺旋藻渣常量元素含量如表2所示，其中鈣含量較高為23 150 mg/kg，微量元素鉀、鐵、鋅等含量也很豐富，所以將螺旋藻渣開發為動物飼料是一種良好的元素補充劑。螺旋藻渣中重金屬元素含量如表3所示，與國標GB 5009.268-2016《食品安全國家標準食品中多元素的測定》的比較，由表可知螺旋藻渣中含有鉛為0.01 mg/kg，其他重金屬元素均未檢出，符合國家食品安全標準。

2.3 螺旋藻渣氨基酸組成與總氨基酸含量

螺旋藻渣中氨基酸組成對其作為菌種發酵原料具有重要的參考意義，螺旋藻渣氨基酸組成如表4所示。

表4 螺旋藻渣的氨基酸組成（干基）Table 4 Amino acids composition of spirulina residue（dry basis）

由表4可見，螺旋藻渣中含有氨基酸種類齊全，總量達到370.2 mg/g。閆春宇等[17]研究顯示螺旋藻中總氨基酸含量在309.94 mg/g～505.95 mg/g；螺旋藻渣中總氨基酸含量與此研究中的報道值相近。與螺旋藻相比，螺旋藻渣中各氨基酸含量均低于螺旋藻，但氨基酸含量的總體趨勢未發生變化，特別是谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸含量尤為突出。因此，螺旋藻渣氨基酸含量高、種類豐富，可作為培養菌種生長繁殖的良好基料。

2.4 不同發酵凍干產物中可溶性蛋白含量分析

不同發酵凍干產物中可溶性蛋白含量見圖1。

圖1 不同螺旋藻渣發酵凍干產物中可溶性蛋白含量Fig.1 Soluble protein content in lyophilized products of different spirulina residue fermentation

圖1表明，不同菌種發酵螺旋藻渣的上清液凍干產物中，可溶性蛋白含量最高的是地衣芽孢桿菌YA269發酵產物，含量為27.6 mg/mL，其次為枯草芽孢桿菌YA215和羅伊氏乳桿菌LT906發酵產物，含量分別為21.4 mg/mL和15.2 mg/mL，酵母菌NBRC10858和保加利亞乳桿菌YB177發酵產物與空白組沒有顯著性差異（P＞0.05）?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌分別是中性蛋白酶和堿性蛋白酶的重要生產菌株[18-19]，因此其發酵產物中可溶性蛋白的來源可能是蛋白酶和部分螺旋藻渣蛋白的混合物。萬心怡等[20]和徐海燕等[21]研究表明羅伊氏乳桿菌生長代謝過程中產生的細菌素是一類具有蛋白特性的物質，故推測羅伊氏乳桿菌發酵產物中可溶性蛋白部分為細菌素。

2.5 不同發酵凍干產物中多肽含量分析

不同菌種發酵螺旋藻渣的發酵產物中多肽含量見圖2。

由圖2可知，發酵產物中多肽含量相對較高的為枯草芽孢桿菌YA215和地衣芽孢桿菌YA269發酵液，兩者并無顯著性差異（P＞0.05）。在發酵過程中，由于枯草芽孢桿菌YA215和地衣芽孢桿菌YA269自身代謝產生的蛋白酶能酶解螺旋藻渣蛋白，因而發酵產物中多肽含量比其他3種菌株發酵液偏高。

2.6 不同發酵凍干產物的抗氧化能力

不同螺旋藻渣發酵產物對DPPH和ABTS+自由基清除能力如圖3所示。

圖2 不同螺旋藻渣發酵凍干產物中多肽含量Fig.2 Poly peptide content content in lyophilized products of different spirulina residue fermentation

圖3 不同螺旋藻渣發酵凍干產物對DPPH和ABTS+自由基清除能力Fig.3 The free radical scavenging capacity of different spirulina residue fermentation lyophilized products to DPPH and ABTS

5種螺旋藻渣發酵凍干產物中，枯草芽孢桿菌YA215、地衣芽孢桿菌YA269和羅伊氏乳桿菌LT906有較好的清除DPPH自由基的能力，但三者數值較為接近，并無太大差異性（圖3A）。在ABTS+自由基清除能力上，5種菌株發酵液均有一定的清除ABTS+自由基效果，枯草芽孢桿菌YA215和地衣芽孢桿菌YA269發酵液清除ABTS+自由基能力最為突出，清除率均達到75%以上（圖3B）。因此，總體來說，枯草芽孢桿菌YA215和地衣芽孢桿菌YA269發酵產物抗氧化能力最強，其次為羅伊氏乳桿菌LT906，酵母菌NBRC10858和保加利亞乳桿菌YB177發酵產物抗氧化能力最弱。

2.7 不同發酵凍干產物的體外膽酸鹽結合能力

體外膽酸鹽的結合能力強弱是降血脂活性的重要體現[22]，不同螺旋藻渣發酵凍干產物對膽酸鹽結合能力見圖4。

圖4 不同螺旋藻渣發酵凍干產物對膽酸鹽結合能力Fig.4 The capacity of different spirulina residue fermentation lyophilized products to bind sodium cholate

如圖4所示，5種螺旋藻渣發酵產物對不同膽酸鹽的結合能力趨勢保持一致性。與陽性對照考來烯胺相比，膽酸鹽結合能力相對較強的是羅伊氏乳桿菌LT906發酵產物，其次為枯草芽孢桿菌YA215和酵母菌NBRC10858發酵產物，最弱的是地衣芽孢桿菌YA269和保加利亞乳桿菌YB177。有研究報道指出，乳酸菌等益生菌在生長發酵過程中產生的胞外多糖及細菌素具有調控降血脂降血糖等功能活性[23]。因此，螺旋藻渣發酵產物的膽酸鹽結合能力可能也與此有關。

2.8 不同發酵凍干產物的抑菌活性

不同螺旋藻渣發酵凍干產物對致病菌的抑菌率見表5。

由表5可知，酵母菌NBRC10858對食源性致病菌均沒有抑菌效果，抑菌效果較好的是枯草芽孢桿菌YA215和地衣芽孢桿菌YA269發酵產物，這可能是由于其發酵產物中的可溶性蛋白和小分子多肽物質發揮了抗菌作用[24-25]。羅伊氏乳桿菌LT906和保加利亞乳桿菌YB177對5種致病菌也有不同程度的抑菌效果，這可能是由于乳酸菌生長代謝過程中產生的有機酸及細菌素起到了一定的抗菌作用。吳惠貞等[26]研究表明羅伊氏乳桿菌發酵液對大腸桿菌具有良好抑菌效果，且分析其抑菌物質可能是由小分子肽、有機酸和過氧化氫等組成。魏薇薇等[27]研究的保加利亞乳桿菌發酵液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌也有不同程度的抑菌效果。

表5 不同螺旋藻渣發酵凍干產物對致病菌的抑菌率Table 5 The inhibition rate of different spirulina residue fermentation lyophilized products to pathogenic bacteria %

3 結論

螺旋藻渣是一種蛋白質含量高，氨基酸種類豐富的副產物原料，經枯草芽孢桿菌YA215和地衣芽孢桿菌YA269兩種菌株發酵后，發酵產物中可溶性蛋白和小分子多肽含量得到顯著提高，且抗氧化能力增強，對食源性致病菌具有廣泛的抑菌作用。同時，螺旋藻渣經羅伊氏乳桿菌LT906發酵后，其發酵產物表現出良好的體外降血脂活性。因此，若將發酵后的螺旋藻渣應用于飼料配料，則可提高動物的抗病性，從而有效提高螺旋藻渣的價值。本研究為螺旋藻渣資源的開發利用提供了一條新途徑。