HPLC-AFS測定雞肝中的阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的不確定度評估

劉國紅，崔穎，*，趙良娟，周磊

（1.天津海關動植物與食品檢測中心，天津300461；2.天津海關工業產品安全技術中心，天津300308）

在報告測量結果時不僅要給出測定的量值是多少，還應給出以數量表示的該值分散程度是多少[1]。它是測量質量的指標，用于判斷該測定值的可靠程度。測量不確定度是“表征賦予被測量值分散性的非負參數”。本研究根據CNAS-CL07：2011《測量不確定度的要求》、JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》的規定和JJG 169-2006《常用玻璃量器檢定規程》，采用了于2020年7月1日實施的SN/T 2316-2019《出口動物源食品中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷殘留量的檢測方法》[2-4]中新增的檢驗方法，采用微波消解-液相色譜-原子熒光光譜法測定動物源食品中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷殘留量，結合實驗室日常檢測能力與條件，進行測量不確定度分析與評定，為今后評價阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷測定結果的準確性和可靠性提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

雞肝：市售。

1.1.2 試劑

甲醇（色譜級）：德國Merck公司；鹽酸、硼氫化鉀、磷酸二氫鉀、過硫酸鉀（優級純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（優級純）：北京化工廠；三氟乙酸（優級純）：上海天蓮精細化工有限公司。

1.1.3 儀器

LC-AFS9750型液相色譜-原子熒光光譜儀：北京海光公司；Multiwave PRO型微波消解系統：奧地利Anton Paar公司；T18組織勻漿機：德國IKA公司；Alpha 1-4/LD-plus型凍干機：德國Christ公司；Milli-Q Reference型超純水儀：德國Millipore公司；VORTEX型渦輪混合器：美國Scientific Industries公司；3-30K型高速冷凍離心機：美國SIGMA公司；N-EVAP-24型水浴氮吹儀：美國Organomation Associates Inc公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取試樣2 g（精確至0.001 g）于微波輔助萃取罐中，加入25 mL甲醇溶液（1∶1，體積比），按照微波輔助萃取儀的標準操作步驟進行提取。提取完畢，取出冷卻至25℃，10 000 r/min離心10 min。取10 mL上清液，氮氣吹掃，用甲醇溶液（1∶1，體積比）定容至5 mL，經0.45 μm有機濾膜過濾后進行測定。按同一操作方法作空白試驗。

1.2.2 標準溶液配制

阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷標準工作液：準確稱取適量的阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷標準品，用去離子水配成濃度為500 μg/mL的標準儲備液。再用去離子水稀釋成1.00 mg/L標準工作液。

1.2.3 樣品測定

設定好儀器測量最佳條件，根據所用儀器的型號和工作站設置相應的參數，點火及對儀器進行預熱，預熱30 min后進行標準曲線及試樣溶液的測定。

1.3 測量模型的構建

1.3.1 被測物含量的測量模型

計算試樣中阿散酸（或硝苯砷酸或洛克沙砷）殘留量的公式如下：

式中：Xi為試樣中被測物的殘留量，mg/kg；c1為樣液中被測物的濃度，μg/L；c0為空白液中被測物的濃度，μg/L；V為樣液體積，mL；V1為吸取上清液體積，mL；V2為最終定容體積，mL；m為最終樣液所代表的試樣量，g。

1.3.2 標準工作曲線的測量模型

以標準系列溶液中目標化合物的濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到公式如下：

式中：y為色譜峰面積；c為標準系列溶液中目標化合物的濃度，μg/L；a為斜率；b為截距。

不確定度來源見圖1。

圖1 不確定度來源的因果關系圖Fig.1 Causal relationship of the sources of uncertainty

2 結果與分析

2.1 試樣質量m的不確定度評定

評估不確定度時，應集中精力分析最大的不確定度分量。質量m的不確定度有2個主要來源：一是重復性變化，可以通過10次連續稱量測量，采用A類方法評定，該重復性通過試驗合成重復性考慮；二是天平校準引入的不確定度，按B類方法評定。

檢定校準證書上給出天平在20℃時的測量結果的不確定度U=4.5 mg，k=2，則天平的標準不確定度為uc（m）=4.5÷2=2.2 mg，其相對不確定度為ur（m）=uc（m）÷m=2.2÷2026=0.001 1。

2.2 體積V、V1、V2不確定度評定

該不確定度主要有3個方面：一是重復性變化，采用A類方法評定，該重復性也通過試驗合成重復性考慮；二是校準不確定度，三是溫度影響，均按B類方法評定。

2.2.1 校準引入的不確定度分量

根據檢定校準證書，25 mL容量瓶的允差為±0.025 mL，10 mL 移液管的允差為±0.010 mL，5 mL容量瓶的允差為±0.005 mL。假設均為三角形分布，則包含因子為，因此標準不確定度分別為

2.2.2 溫度系數引入的標準不確定度分量

檢定或校準是在室溫20℃環境條件下進行的[3]，本研究的溫度波動范圍為±3℃（置信水平為95%）。水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1假設正態分布，其包含因子為1.96。25 mL容量瓶、10 mL移液管和5 mL容量瓶，因溫度控制不充分而產生的標準不確定度分別為：

2.2.3 體積V、V1、V2的合成標準不確定度u（cV）、uc（V1）、u（cV2）

其相對不確定度為

2.3 濃度c的不確定度評定

濃度c的不確定度由3個部分組成：一是由擬合標準工作曲線求得c時測量所產生的不確定度；二是標準儲備液的純度對c測量帶來的不確定度；三是由標準儲備液配制成不同濃度標準應用液所產生對c測量帶來的不確定度；均按B類方法評定。

2.3.1 擬合標準工作曲線求得c時引入的不確定度分量

阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的線性范圍、線性方程和相關系數見表1，阿散酸標準使用液的峰面積見表2，洛克沙砷標準使用液的峰面積見表3，硝苯砷酸標準使用液的峰面積見表4[3，5]。

表1 阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的線性范圍、線性方程和相關系數Table 1 Linear range，linear equation and correlation coefficient of p-arsanilic acid，4-nitrophenylarsonic acid，3-nitro-4-hydroxyphenylarsonic acid

表2 阿散酸標準使用液的峰面積Table 2 Peak areas of p-arsanilic acid standard working solution

表3 洛克沙砷標準使用液的峰面積Table 3 Peak areas of 3-nitro-4-hydroxy-phenylarsonic acid standard working solution

表4 硝苯砷酸標準使用液的峰面積Table 4 Peak areas of 4-nitrophenylarsonic acid standard working solution

依據試驗，對一份雞肝加標樣品進行3次重復測量，由峰面積通過線性回歸方程求得c阿散酸=48.25 μg/L，c洛克沙砷=45.77 μg/L，c硝苯砷酸=46.20 μg/L 則殘差標準偏差為：

2.3.2 標準儲備液純度引入的不確定度分量

計算標準儲備液純度引入的不確定度分量[6]。由標準物質證書獲得阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸標準物質的擴展不確定度分別為1 ng/mL（k=2），因此標準不確定度為：

2.3.3 混合標準儲備液稀釋操作的不確定度評定

進行混合標準儲備液稀釋操作引入的不確定度評定[5]。混合標準儲備使用經檢定或校準的移液槍和單標線A級容量瓶，進行二級稀釋，配制成混合標準使用液。因此稀釋倍數是

根據計量檢定證書，1 mL移液槍、A級50 mL容量瓶和10 mL容量瓶的允差分別為±0.01 mL、±0.05 mL和±0.03 mL[3]，在（20±3）℃條件下進行，其相對不確定度 為

2.3.4 濃度c的相對標準不確定度

計算濃度c的相對標準不確定度[5-8]。

2.4 回收率的不確定度評定

進行回收率引入的不確定度評定[9-11]。分別在空白的雞肝基質中添加0.50 mg/kg的混合標準液，包含n=6次平行試驗，m=3×6=18，另取兩份作為空白試驗，均按照試驗方法操作，并且進行外標法定量，結果見表5。

對測量結果求得相對標準偏差為

表5 回收試驗結果（n=6）Table 5 Results of test for recovery（n=6）

2.5 重復性的不確定度評定

進行重復性引入的不確定度評定[12-13]。對同一雞肝樣品進行n=11次獨立重復性試驗，所得阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的總量分別為0.849、0.863、0.852、0.875、0.888、0.869、0.862、0.850、0.883、0.869、0.858 mg/kg，平均值=0.865 mg/kg，采用貝塞爾公式計算，標準不確定度等于一倍標準偏差；其相對不確定度為

2.6 合成標準不確定度的評定

表6 不確定度各分量的分析結果Table 6 Uncertainly in each quantity

由表6，其合成相對標準不確定度[14-15]為：，取包含因子k=2，雞肝中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸含量的擴展不確定度：U（X）=k×ur（X）×X=2×0.133×0.865=0.230 mg/kg，該雞肝中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸含量X為：0.865 mg/kg±0.230 mg/kg。

3 結論

評定雞肝中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸含量測量不確定度，分析測量過程中存在的不確定度來源。通過各不確定度分量的分析與比較得知，使用線性最小二乘法擬合曲線程序的前提是假定橫坐標的量的不確定度與縱坐標的量的不確定度相差極大，因此濃度c的不確定度計算程序僅僅與峰面積不確定度有關，而標準儲備液純度和逐次稀釋的不確定度足夠小以至于可以忽略；另外，引起測量不確定度的最主要來源是測定c值時用最小二乘法擬合標準工作曲線所引入的不確定度。因此，試驗人員在實際操作中應引起重視，嚴格按照高效液相色譜-原子熒光光譜聯用儀操作規程進行操作，定期做好儀器的計量檢定和期間核查工作，使儀器的技術性能處于良好狀態是保證測定結果準確的重要手段，同時擇優選擇移液器具，從而保證該標準方法可靠，檢測結果準確。