葛仙米藻粉對便秘大鼠腸神經遞質、ICC及水通道蛋白的影響

劉銀路，畢萃萃，楊麗濤，魏芬芬，張波

（生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，功能食品科學技術研究院，北京聯合大學，北京100191）

便秘是一種常見的腸道疾病，主要表現為便秘患者大便量減少、直腸脹感并排便困難，且具有治療周期較長、易反復發作等特點，嚴重困擾患者的身心健康。現代生活方式的改變以及人口老齡化趨勢的日益加重，使便秘患病率不斷升高。便秘還可以誘導多種疾病的發生[1]。目前緩解便秘的藥物主要包括瀉藥、滲透劑、潤滑劑等，這些藥劑在短時間有較好的作用，但是長時間服用此類藥物會有不同程度的毒副作用，如長期服用番瀉葉、大黃等蒽醌類瀉藥會導致結腸黑病變，嚴重者可能會導致結直腸腫瘤等疾病的發生[2-4]。故許多研究者致力于挖掘和開發低毒副作用的緩解便秘的藥食兩用天然產物。葛仙米作為一種傳統藥食兩用淡水微藻，有悠久的食用歷史，俗稱天仙米、天仙菜。學名為擬球狀念珠藻，屬藍藻綱，念珠藻科，念珠藻屬。野生葛仙米在世界上有極少分布，我國主要分布在湖北省鶴峰縣走馬坪鎮。目前我國已采用人工培養技術生產葛仙米，其營養成分與野生葛仙米類似[5]。研究表明，葛仙米含有豐富的營養物質，尤其是富含膳食纖維以及蛋白質、多種維生素和其它人體必需的元素錳、鈣、鋅、鐵、磷等成分，具有抗炎抗菌、抗癌、降血脂、潤腸通便等功效[5-8]。中樞神經系統（central nervous system，CNS）和腸神經系統（enteric nerves system，ENS）作為腦-腸軸的兩個“終端”，其結構和功能的異常是影響腸道功能的重要物質基礎。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、血管活性腸肽（vasoacticeintestinalpolypeptide，VIP）、P 物質 （substance P，SP）作為CNS和ENS信息傳遞中的重要神經遞質，在胃腸道功能的調節中起著重要的作用[9]。結腸吸收水分的功能與結腸黏膜上皮細胞水通道蛋白（aquaporins，AQPs）的表達有密切的關系[10-11]。Cajal間質細胞是胃腸道的起搏細胞，其細胞膜上存在多種神經遞質受體，是參與神經支配胃腸蠕動的重要結構基礎。Cajal間質細胞（interstitial cell of Cajal，ICC）結構、功能以及數量的改變也是影響胃腸動力的重要原因[12-13]。本實驗采用鹽酸洛哌丁胺制造大鼠便秘模型，通過研究便秘大鼠結腸ICC細胞、腸神經遞質5-HT、VIP以及SP分泌、結腸水通道蛋白AQP3、AQP4表達，探討葛仙米藻粉對便秘大鼠的通便作用及作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

葛仙米超細粉：湖南炎帝生物公司，在-20℃將葛仙米研磨成超細粉，直接供本實驗使用，其中膳食纖維（47.3%）、蛋白質（30.8%）、水分（5.54%）、灰分（5.7%）；鹽酸洛哌丁胺（每粒2 mg）：西安楊森制藥有限公司，國藥準字H10910085。

1.2 試驗儀器

PL-203電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-12J脫水、JB-P5包埋機、JB-L5凍臺：武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機：上海徠卡儀器有限公司；KD-P組織攤片機：浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；TSY-B脫色搖床、MX-F渦旋混合器：武漢賽維爾生物科技有限公司；GT1001組化筆：美國基因泰克公司；XSP-C204顯微鏡：徠卡顯微系統（上海）有限公司；JY92-Iin超聲細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機：力康生物醫療科技控股有限公司；TL-420D水浴鍋：姜堰市天力醫療器械廠有限公司：RT3100自動洗板機：深圳雷杜生命科學股份有限公司；Epoch酶標檢測儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物

SPF級健康SD大鼠24只（體質量130 g～150 g，雄性）：北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004。將大鼠置于SPF級動物房中，溫度（22±2）℃，濕度 50%～60%，每日光照和黑暗各12 h，大鼠適應性喂養1周后隨機將大鼠分為3組：對照組6只，模型組6只，葛仙米組12只。分組后各組體重之間無顯著性差異，大鼠均單籠飼養。實驗進行4周。第1周至第3周：每天上午9∶00，葛仙米組大鼠給予0.8 g/kg劑量葛仙米灌胃，對照組與模型組給予等量生理鹽水進行灌胃；第4周：模型組每天早上7∶00灌胃鹽酸洛哌丁胺（3 mg/kg），2 h后等量生理鹽水進行灌胃；葛仙米組每天早上7∶00灌胃鹽酸洛哌丁胺（3 mg/kg），2 h后灌胃0.8 g/kg的葛仙米；對照組每天早上7∶00和9∶00灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 大鼠體重及進食量變化

大鼠喂養期間，記錄大鼠體重以及進食量的變化。

1.3.3 腸道動力實驗

實驗第4周末，早上7∶00模型組和葛仙米組大鼠給予鹽酸洛哌丁胺灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃，9∶00各組給予墨汁灌胃，正常飲食，每間隔30 min觀察1次，記錄首粒黑便時間。

1.3.4 ELISA實驗測定結腸組織中5-HT、VIP、SP水平

用10%水合氯醛0.5 mL/100 g將大鼠麻醉后，腹主動脈放血處死大鼠，取大鼠結腸組織用生理鹽水清洗，研磨制備10%的組織勻漿，4 000 r/min，20 min離心吸取上清，然后按照ELISA實驗說明書測定組織勻漿中的 5-HT、VIP、SP 含量。

1.3.5 免疫組化實驗測定結腸組織中c-kit含量

取大鼠結腸組織，PBS沖洗、4%多聚甲醛固定，常規包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復。滴加c-kit一抗，37℃孵育2 h，4℃過夜。分別滴加生物素標記的二抗和過氧化物酶溶液15 min，二氨基聯苯胺（3，3’-di aminobenzidine，DAB）顯色 10 min。常規脫水透明，封片。CKX41倒置熒光顯微鏡觀察，腸組織切片出現特異性的棕褐染色為陽性。分析：每組內每張切片隨機挑選400倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（integrated optical density，IOD）以及組織的像素面積AREA。并求出平均光密度值（average optical，AO 值），AO=IOD/AREA，AO 值越大表明陽性表達水平越高。

1.3.6 免疫組化法測結腸組織中AQP3、AQP4含量

采用免疫組化法檢測各組小鼠結腸組織中AQP3、AQP4表達情況：組織制成石蠟切片，將石蠟切片置于烘箱中58℃烤2 h～4 h；石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3 min×3 min；0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復液pH 6.0煮沸熱修復（95℃15 min），保溫15 min，室溫自然冷卻，PBS洗3 min×3 min；3%H2O2抑制內源性過氧化物酶室溫孵育10 min；PBS洗3 min×3 min；10%正常胎牛血清室溫孵育30 min，PBS洗3 min×3 min；一抗4℃孵育過夜；PBS洗3 min×3 min；二抗37℃孵育1.5 h；PBS洗3 min×3 min；DAB顯色3 min～5 min；蘇木素復染30 s，鹽酸酒精分化1 s；脫水吹干后，樹脂封片；分析：每組內每張切片隨機挑選400倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（integrated optical density，IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值（average optical，AO值），AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽性表達水平越高。

1.3.7 數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計，數據采用xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析；組間差異有統計學意義時，采用最小顯著法進行組間的兩兩比較，以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 葛仙米對大鼠體重與進食量的影響

各組大鼠生長期間飲食量變化見表1，各組大鼠體重變化見表2。由表1看出，各組大鼠初始體重無差別，在后續生長過程中雖然葛仙米組大鼠與模型組和對照組大鼠相比略有下降，但并無顯著性差異。表示葛仙米對大鼠生長無明顯影響。實驗結束時對照組與葛仙米組動物活動正常，毛發狀況良好，模型組大鼠有毛皮光澤暗淡、喜臥、嗜睡等現象。表2中顯示，大鼠在實驗中進食量無顯著性差異，灌胃鹽酸洛哌丁胺的一周中，大鼠進食量稍有減少，但無顯著性差異。

表1 各組大鼠生長期間飲食量變化Table 1 Changes in dietary dose during growth of each group of rats

表2 各組大鼠體重變化Table 2 Changes in body weight during growth of each group of rats

2.2 葛仙米對大鼠首次產生黑便時間的影響

葛仙米對大鼠產生首粒黑便影響見表3。

表3 葛仙米對大鼠產生首粒黑便影響Table 3 Effects of Nostoc sphaeroides kiitzing on the first black stool in rats

由表3可知，與對照組相比，模型組首粒黑便產生時間極顯著延長（p<0.01），表明大鼠便秘模型成立。葛仙米組與模型組大鼠相比，首粒黑便產生時間極顯著縮短（p<0.01），表明葛仙米有助于腸道推進。

2.3 葛仙米對結腸組織5-HT、VIP、SP含量的影響

葛仙米對結腸組織5-HT、VIP、SP含量的影響見圖1。

與對照組比較，模型組結腸組織中神經遞質5-HT、SP含量顯著降低，差異具有極顯著性（p<0.01），VIP含量顯著升高，差異具有顯著性（p<0.05）。與模型組相比，葛仙米組結腸組織中神經遞質SP含量顯著性升高（p<0.05），5-HT 含量極顯著升高（p<0.01），而VIP含量顯著降低（p<0.05）。

圖1 葛仙米對結腸組織5-HT、VIP、SP含量的影響Fig.1 Effect of Nostoc sphaeroides kiitzing on the contents of 5-HT，VIP and SP in colonic tissue

2.4 葛仙米對結腸ICC的影響

免疫組化觀察大鼠結腸c-kit表達見圖2。

圖2 免疫組化觀察大鼠結腸c-kit表達（400×）Fig.2 Immunohistochemical observation of c-kit expression in rat colon（400×）

如圖2所示，光鏡下觀察組織結構，模型組ICC陽性細胞胞體較小，著色較淺，相鄰ICC陽性細胞網絡結構不連續。與模型組比較，葛仙米組ICC陽性細胞胞體較大，著色較深。基本接近于對照組。結腸c-kit表達情況，模型組大鼠極顯著低于對照組，而葛仙米組極顯著高于模型組（p<0.01），與對照組基本一致。

2.5 葛仙米對AQP3、AQP4影響

免疫組化觀察大鼠結腸組織中AQP3、AQP4表達見圖3。

圖3 免疫組化觀察大鼠結腸組織中AQP3、AQP4表達（400×）Fig.3 Immunohistochemical observation of AQP3 and AQP4 expression in rat colon tissue（400×）

從圖3可以看出，AQP3在結腸頂膜處陽性表達更為明顯，陽性部分為黃褐色。AQP4在結腸中均有陽性表達，其中暗黃色部分為陽性表達區域。與對照組比較，模型組結腸AQP3極顯著降低，AQP4極顯著升高（p<0.01）。葛仙米組AQP3水平極顯著高于模型組、AQP4水平極顯著低于模型組（p<0.01）。

3 討論與結論

便秘是常見的胃腸疾病之一，老年人尤為常見。便秘往往給患者帶來明顯的身體不適，可引起肛裂、肛周感染、肛瘺以及腸梗阻等，此外便秘也是老年人心腦血管疾病的死亡誘導原因之一，可以誘發血管破裂、心律失常，使患者產生煩躁抑郁等不良情緒[14-16]。葛仙米為藥食同源藍藻，富含多糖類膳食纖維（多糖類含量高達50%左右），且主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖以β-（1，4）糖苷鍵組成[17-18]。該多糖具有吸水性強、黏度大、膨脹率高的特點，進入腸胃后可吸收胃腸中的水分，使內容物體積膨脹，增加腸道容積，并且使腸道潤滑，利于排便。

胃腸運動除了通過交感和副交感神經的去甲腎上腺素和乙酰膽堿進行調節外，還有許多神經遞質包括VIP，SP物質等從中樞和外周調節著胃腸道的運動功能。ENS是局部獨立的神經系統，其作用在于協調平滑肌細胞和ICC，三者共同組成胃腸道調控結構，保證胃腸道各項功能協調運行[19]。5-HT主要在胃腸道合成，嗜鉻細胞感受腸腔內刺激后釋放大量5-HT，通過受體發揮作用，調節CNS與ENS之間的感覺傳遞[20]。SP廣泛分布于中樞和周圍神經纖維內，在神經受刺激后，末梢將釋放SP發揮一系列生理作用，對胃腸道平滑肌產生強烈的刺激作用，促進腸蠕動、增加結腸內壓力、加速排瀉，同時SP還可以刺激5-HT的釋放，激活肥大細胞釋放組胺，從而發揮其對消化道平滑肌的強刺激作用。反過來5-HT、組胺又能促進感覺神經末梢分泌SP。VIP是一種由副交感神經節后纖維釋放的多肽類激素，在結腸黏膜下神經叢的表達最多。VIP可舒張腸道平滑肌、促進腸道水分和電解質的分泌，但過度分泌會抑制腸道運動、舒張平滑肌[21，22]。本實驗中，模型組灌胃鹽酸洛哌丁胺1周后，大鼠產生首粒黑便的時間顯著大于對照組，且結腸組織5-HT及SP水平顯著降低、VIP水平顯著升高，引起便秘。葛仙米組采用先灌胃葛仙米3周，第4周灌胃葛仙米的同時再灌胃鹽酸洛哌丁胺，葛仙米組大鼠產生首粒黑便的時間顯著小于模型組，且結腸組織5-HT及SP水平顯著升高、VIP水平顯著降低，便秘癥狀得到緩解。這些結果提示，在葛仙米緩解大鼠便秘的作用機制中，腸神經遞質5-HT、SP以及VIP可能起著重要的作用。

AQPs是蛋白質家族中一組特異性轉運水的蛋白質，參與組織水的分泌、吸收及平衡細胞內外壓，有幫助水分子快速通過細胞膜作用，AQPs在哺乳動物消化道中有9種亞型，其中AQP3主要分布在結腸組織黏膜頂部，AQP4主要存在于小腸隱窩細胞和結腸表面上皮細胞的基底外側膜，它們在結腸水液代謝過程中起到重要作用，如果AQPs表達異常，就可導致腸道水液平衡紊亂[23-24]。本實驗中，模型組灌胃鹽酸洛哌丁胺1周后，結腸組織AQP3水平顯著低于對照組，AQP4水平顯著高于對照組。葛仙米組結腸組織AQP3水平顯著高于模型組，AQP4水平顯著低于模型組。此結果表明，葛仙米可能通過上調AQP3水平、下調AQP4水平來調節腸道水液代謝，從而增加糞便含水量，利于糞便的排除。

ICC是一種非神經但又與神經密切相關的特殊間質細胞，廣泛存在于哺乳動物和人的消化道管壁內，ICC是腸道慢波信號起搏細胞，參與調控了腸神經信號傳遞過程。ICC的缺失會引起胃腸功能的異常。c-kit為原癌基因，編碼Kit受體，幾乎在所有的ICC都表達，因此也成為檢測Cajal間質細胞存在的重要標志。Cajal間質細胞結構、功能、數量及分布的改變是胃腸動力障礙的主要原因[25-26]。本實驗中，模型組灌胃鹽酸洛哌丁胺1周后，結腸組織c-kit陽性細胞減少，而葛仙米組結腸組織c-kit陽性細胞上調，這可能與葛仙米參與介導Cajal間質細胞數量而調節腸道動力，這個結果與腸道推進實驗結果相吻合，進一步證實葛仙米具有促進腸道運動的作用。總之，從目前研究的結果分析，葛仙米可通過調控腸神經遞質，水通道蛋白以及Cajal間質細胞，有效緩解便秘的癥狀。

此外，大量研究表明，便秘的發生與腸道菌群的變化也有一定關系[27-28]，因此，將進一步研究葛仙米對便秘動物腸道菌群以及代謝產物的影響，多方面探討和闡明葛仙米緩解便秘的作用和機理。