牡蠣多糖的提取與純化

位迎雪 宋 春 劉興祖 于 瀟 盧鈺博 李希磊 崔龍波

(煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005）

地球上豐富的海洋生物資源為人們對新型生物活性物質的發現與研究提供了更多的可能。我國海域遼闊，為我國海產養殖特別是牡蠣養殖提供了便利和優勢。牡蠣是我國四大養殖貝類之一，牡蠣肉富含多種營養物質，其中牡蠣多糖作為一種多糖類物質，因其具有提高機體免疫力、對正常細胞沒有毒副作用的特點以及多種生物學功能，越來越受到人們的重視。

牡蠣多糖作為多糖的一種重要成分，具有多種功能，發揮免疫調節、抗氧化、抗病毒、保護與修復損傷組織、抗凝血和抗血栓等作用。牡蠣多糖可以通過T淋巴細胞介導免疫應答，參與機體的免疫反應。類胰島素1號生長因子(IGF-1)是機體生長、發育和代謝的一個重要調控因子，還可以保護細胞免受免疫應激損傷，抵抗炎癥。丁佳玉等(2019)利用化學方法將有機硒與牡蠣多糖結合在一起，并用其對腫瘤細胞進行處理，結果發現硒化牡蠣多糖能夠有效地清除羥自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，其清除自由基的效果隨硒化牡蠣多糖濃度的升高而增加。牡蠣多糖抗氧化作用的機制為其所含的還原性羥基能夠捕捉脂質過氧化鏈式反應中產生的活性氧，減小脂質過氧化反應鏈長度，因而可阻斷或減緩脂質過氧化反應的進行，從而起到抗氧化的作用。

有學者認為多糖抗病毒的機制是通過抑制病毒早期階段的復制，即多糖阻斷病毒對宿主細胞的入侵。李江斌等(2009)在對牡蠣多糖抑制流感病毒增殖的研究中發現，牡蠣多糖劑量為2毫克/升時的抑制倍數為8，10毫克/升以上時抑制倍數為32，試驗結果表明牡蠣多糖能有效抑制流感病毒的增殖，并且隨著濃度的提高效果也明顯提升。

牡蠣糖胺聚糖是一種重要的牡蠣多糖，李萌等(2008)通過體外給藥的方式檢測牡蠣糖胺聚糖對單純皰疹病毒Ⅰ型的作用效果，結果發現牡蠣糖胺聚糖雖然不能直接殺死該病毒，但能有效保護被該病毒感染的細胞，抑制病毒的擴增。趙冠華等(2018)研究顯示牡蠣多糖能對四氯化碳造成的肝組織急性損傷進行修復，有效緩解肝組織的損傷狀態。侯麗等(2014)研究顯示牡蠣多糖對酒精造成的急性肝臟損傷有一定的保護修復能力。葉邵凡等(2014)通過實驗發現牡蠣多糖可以增強肝組織的抗氧化能力，抑制一氧化氮合酶的活性，從而減少一氧化氮的毒性代謝產物對肝組織造成的損傷，同時能使ATP酶保持活性。

一、牡蠣多糖的提取

利用牡蠣多糖易溶于水而不溶于醇、丙酮等有機溶劑的特點，用化學試劑按照一定的比例和步驟，對新鮮牡蠣材料進行反復提取，從而獲取牡蠣多糖。牡蠣多糖的提取主要有3種方法：超濾膜分離法、水提醇沉法和響應面法。

1.超濾膜分離法

由于牡蠣含有多種生物活性成分，如核酸、蛋白質、無機鹽及其他糖類物質等，會對牡蠣多糖的提取造成干擾，因此要將這些物質全部清除過濾掉。超濾膜分離法是目前比較常用的利用一定的外壓分離高分子物質的方法。采用超濾膜分離法分離牡蠣多糖時，由于在實際操作中選擇的條件存在差別，分離效果也存在差異。鄭亞旭等(2016)通過單因素和正交試驗確定超濾膜分離牡蠣多糖最合適的截留分子量為10千道爾頓，最佳的分離條件為料液溫度40℃、壓力0.04兆帕、pH 6.0。石璇在采用超濾膜法分離牡蠣多糖時，不僅考慮了分離效率，還將生產成本和濾膜的使用壽命作為參考，其得到的最適分離條件為料液溫度30℃、壓力0.04兆帕、pH7.0。超濾膜分離法提取牡蠣多糖的過程雖然較為復雜，但所提取的產品雜質含量低、生產設備簡單，而且具有不損害分離物質活性、能耗低、無污染、分離效率高等優點。

2.水提醇沉法

水提醇沉法作為中藥提取時常用的一種方法，其原理是利用物質在不同濃度乙醇中的溶解度差異而將其分離。黃傳貴等(2009)在研究牡蠣多糖的提取工藝時，就采用了水提醇沉法，他們在去除牡蠣粗提取物中的不溶物之后進行抽濾，向濾液中添加乙醇，離心之后回收沉淀，用系列濃度的乙醇和丙酮洗滌沉淀，真空干燥，最終得到醇沉多糖。水提醇沉法可以分離出不同分子量的牡蠣多糖，并且不同分子量的牡蠣多糖可能具有不同的生物學功能，因此水提醇沉法提取牡蠣多糖對于深入研究其生物學功能具有重要的意義。

在水提醇沉法的基礎上，利用不同的介質進行提取，結果發現提取效率各不相同。根據介質不同可分為3種方法：室溫水提取、熱水提取和稀堿提取。室溫水提取是在室溫條件下攪拌3小時，熱水提取則是在60℃熱水中磁力攪拌2小時，稀堿提取是加入3%的NaOH溶液后在60℃條件下磁力攪拌2小時，但之后要用稀酸中和至中性。結果發現在室溫水提取條件下牡蠣多糖的提取效率及總糖含量最高，并且蛋白質含量最低。所以在利用水提醇沉法提取牡蠣多糖時，在室溫條件下攪拌3小時是提取牡蠣多糖的最佳方法。

3.響應面法

響應面法作為各類科學實驗中常用的一種工藝優化方法，可以連續地對實驗的各個水平進行研究，從而得到更加可靠、合理的結果。牛改改等(2016)利用響應面法優化牡蠣多糖的提取工藝，綜合考慮溫度、液料比和提取時間之間的相互作用，溫度90℃、液料比90∶1、提取時間3小時提取效率最高，有利于提高經濟效益。張碩等(2012)在單因素分析的基礎之上，利用苯酚－硫酸比色法測定牡蠣粗多糖含量并經星點設計－響應面法優化提取工藝，結果表明最佳的牡蠣粗多糖提取條件為：試驗溫度81℃、液料比80∶1、提取時間2.9小時。此外，還可以利用超聲－微波輔助提取牡蠣多糖，一定的震動頻率可以破壞牡蠣細胞膜，促進細胞內有效成分如牡蠣多糖的溢出，再通過響應面法選擇最合適的試驗溫度、料液比、提取時間和超聲－微波功率。

二、牡蠣粗多糖的純化

在牡蠣多糖的提取方法中，除超濾膜分離法外其他方法分離得到的都是牡蠣粗多糖，在后續進行牡蠣多糖的結構和功能研究時，所提取的牡蠣多糖純度遠遠達不到要求，因此需要對提取的牡蠣粗多糖進行分離純化，從而得到更純的牡蠣多糖。牡蠣粗多糖中對研究影響比較大的主要雜質為蛋白質，因此牡蠣粗多糖的純化以除去蛋白質為主要目的。

1.sevag法

sevag法對除去游離的蛋白質非常有效，是牡蠣粗多糖的分離純化中比較常用的一種方法。該法利用化學試劑使蛋白質空間結構改變，降低其在水中的溶解度而析出，再通過離心，得到純度更高的牡蠣多糖。田振華等(2013)利用酶法、sevag法聯合去除蛋白質，對酶解之后的旋蒸液多次用sevag液處理，直到不再產生白色絮狀沉淀，經檢測蛋白質含量下降至1.21%。sevag法作用比較溫和，對牡蠣多糖結構的影響較小，但分離效率較低，需要反復進行多次才能達到理想的效果。利用sevag法去除蛋白質時，sevag的含量、反應物震蕩時間、氯仿和正丁醇的比例以及脫蛋白質次數都會影響最終效率，劉玉佳等(2014)通過試驗得出最佳的提取條件為：sevag含量1/3，反應物震蕩時間為25分鐘，氯仿和正丁醇之比為4∶1，脫蛋白質次數為4次。

2.酶解法

酶解法是利用蛋白酶的水解作用，將蛋白聚糖中的蛋白質和多糖分離。由于蛋白質的種類較多，為了廣泛而有效地水解蛋白質，通常選用專一性較低的蛋白酶，比較常用的有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等。鄭亞旭(2017)在利用酶解法純化牡蠣多糖時，考察了最佳的分離條件，結果發現反應溫度41℃、反應時間4小時、酶與底物之比為3∶500時酶解效果最好，牡蠣多糖的產量最高。

牡蠣作為一種營養價值極的海產品，越來越受到人們的喜愛，牡蠣養殖的發展對沿海經濟做出了巨大貢獻的同時，也為牡蠣多糖的研究提供了豐富的原材料。牡蠣多糖作為一種功能多樣的生物活性物質，在多個領域都具有較高的經濟價值。目前國內對牡蠣多糖的研究及應用還有待加強，本文可為今后的相關研究提供一定的參考。