YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的表達及意義①

黎超蓮，農海斌，盧昱超，彭園園，周英瓊，徐龍寬

(1.桂林醫學院臨床醫學院,廣西 桂林 541001；2.桂林醫學院附屬醫院病理科，廣西 桂林 541001)

鼻咽癌是我國南方省份及東南亞高發的一種惡性腫瘤，有明顯的種族聚集性和地域性,每年的發病率15～50/100 000人[1]。有研究表明，鼻咽癌的發生是一個多階段、多途徑、多機制的過程。各種環境因素、EBV感染、遺傳和表觀遺傳學的改變導致癌基因過表達及抑癌基因表達下調或缺失，經過癌前病變，最終發展成鼻咽癌[2]。目前放療或放化療同步是其主要治療手段，治療后局部復發和遠處轉移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因，5年生存率45%左右。放療的多藥耐藥性影響了鼻咽癌患者的放療效果和生存質量[3]。近幾年，基因靶向治療在腫瘤學上關注度很高，因此，發現特異性的腫瘤標志物應用于臨床早期診斷、干預以及治療具有重要意義。Yes激酶相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)、轉錄聯合激活因子(The transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)是Hippo信號通路的重要成員，主要參與調節器官的發育，并且與腫瘤的形成有關[4]。近年來大量研究發現，YAP、TAZ表達水平的升高或核移位，可見于人類各種系統腫瘤，較為常見的有乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、胃癌[7]等，且敲低YAP、TAZ的表達可以阻止腫瘤細胞的進一步轉移，甚至改善預后。YAP、TAZ的表達水平在某些惡性腫瘤中可以作為獨立預后指標之一[8]，且Hippo信號通路可能影響腫瘤對化療藥物的敏感性，臨床上可通過干預該通路以提高腫瘤的治療效果，提高患者的生存率[9]。β-連環蛋白(β-catenin)是Wnt(wingless-type MMTV integration site family members)信號通路中的重要成員，β-catenin作為Wnt信號通路的關鍵調節因子，兼有胞間連接和信號傳導的功能[10]。筆者闡述了YAP、TAZ、β-catenin三者在鼻咽癌中的作用及其相互關系。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集桂林醫學院附屬醫院病理科2009年1月至2013年12月存檔的100例鼻咽癌組織蠟塊作為實驗組，另取同期非腫瘤鼻咽黏膜組織30例作為對照組。所有患者術前沒有經過臨床的化學治療以及生物治療，且臨床及病理資料完整。100例鼻咽癌患者年齡13～75(47.5±13.2)歲，其中<50歲56例，≥50歲44例，根據TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期86例，Ⅲ～Ⅳ期14例。病理分型：非角化性未分化型癌92例，非角化性分化型癌8例。

1.2 實驗方法及試劑

本實驗所納入的組織標本均使用以下方法處理：①10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。②4.0 μm連續切片，常規脫蠟至水后，EDTA(pH 8.0)高壓修復抗原；PBS沖洗。③PBS沖洗3次，3 min/次，后用H2O2浸泡10 min；PBS沖洗3次，3 min/次；滴加羊血清(購自北京中杉金橋生物技術有限公司，稀釋倍數 1∶10)，置于37 ℃溫箱中封閉30 min。④滴加一抗，PBS沖洗3次，3 min/次，后滴加二抗，室溫放置15 min。⑤PBS沖洗3次，3 min/次，然后用DAB(購自福州邁新生物技術開發有限公司)顯色。⑥蘇木精復染。⑦中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，以陽性表達的乳腺癌組織為陽性對照。鼠源性YAP單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，稀釋濃度為1∶200；兔源性TAZ多克隆抗體購自武漢尚恩生物技術有限公司，稀釋濃度為1∶1 000；兔源性β-catenin多克隆抗體購自武漢博士德生物公司，稀釋濃度為1∶200；即用型免疫組化Eli Vision TMsuper試劑盒(鼠/兔)和免疫組化一抗稀釋液均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 判斷方法與標準

每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野記數100個細胞。判斷標準：①按陽性著色程度評分：0分為無著色，與背景色一致；1分為稍淺黃色，比背景顏色略深；2分為棕黃色，明顯比背景色深；3分為棕褐色。②按陽性細胞所占比例評分：0分為陰性；1分為10%以下；2分為11%～50%；3分為51%～75%；4分為75%以上。每張切片以兩者乘積判定陽性結果：0～2分為陰性(-)；3～4分為弱陽性(+)；5～8分為中度陽性(++)；9～12分為強陽性結果(+++)，將≥3分定為陽性結果，<3分定為陰性結果。

1.4 統計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，計數資料用%表示，差異性分析采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。采用χ2檢驗對YAP、TAZ之間的相關性進行分析。

2 結果

2.1 YAP、TAZ、β-catenin在不同組織中的表達

YAP、TAZ以細胞核或細胞質出現棕黃色顆粒為陽性表達，β-catenin在非腫瘤鼻咽黏膜組織中主要以細胞膜著色為主，而在鼻咽癌組織中除了細胞膜著色還出現細胞漿的異位表達(見圖1)。實驗組100例鼻咽癌組織中，YAP、TAZ、β-catenin的陽性例數、陽性表達率分別為91(91.0%)、64(64.0%)、81(81.0%)。30例非腫瘤鼻咽黏膜組織中，YAP、TAZ、β-catenin的陽性例數、陽性表達率分別為10(33.3%)、1(3.3%)、12(40.0%)。YAP、TAZ在鼻咽癌組織的陽性表達率顯著高于非腫瘤鼻咽黏膜組織(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌組織中的異位表達率明顯高于非腫瘤鼻咽黏膜組織(P<0.05)。詳見表1。

表1 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織、非腫瘤鼻咽黏膜組織中表達(n，%)

A、B：YAP在非腫瘤鼻咽黏膜組織、鼻咽癌組織中的表達；C、D：TAZ在非腫瘤鼻咽黏膜組織、鼻咽癌組織中的表達；E、F：β-catenin在非腫瘤鼻咽黏膜組織、鼻咽癌組織中的表達

圖1 非腫瘤鼻咽黏膜組織、鼻咽癌組織中YAP、TAZ、β-catenin的表達(SP×200)

2.2 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌中的表達及與臨床病理參數間的關系

YAP、TAZ在鼻咽癌組織中的陽性表達率與鼻咽癌的病理分型有關(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌組織中的異位表達率與鼻咽癌的病理分型有關(P<0.05)；TAZ在鼻咽癌中的陽性表達率與性別、5年生存率有關(P<0.05)，而與年齡、臨床分期、有無遠處轉移、淋巴結轉移無顯著關系(P>0.05)；YAP、β-catenin在鼻咽癌中的異常表達率與性別、年齡、臨床分期、有無遠處轉移、淋巴結轉移、5年生存率無顯著關系(P>0.05)。詳見表2。

表2 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的表達及與臨床病理參數間的關系(n)

2.3 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的表達相關性分析

在91例YAP陽性表達組中，YAP、TAZ共陽性表達61例，在9例 YAP陰性表達組中，YAP、TAZ共陰性表達6例，χ2檢驗提示在鼻咽癌組織中，YAP與TAZ蛋白在鼻咽癌中的表達成正相關(P=0.045)；YAP、TAZ表達與β-catenin蛋白異位表達成正相關(P<0.05)。詳見表3。

表3 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的表達及其相關性分析

3 討論

在哺乳動物中YAP和TAZ是Hippo通路的下游效應分子，YAP基因定位于人類染色體11q22，在正常生理狀態下廣泛表達于機體組織中。TAZ也被稱為WWTR1，TAZ與YAP同源，兩者之間有46%氨基酸序列是相同的[11]。Hippo信號通路調控腫瘤發生，YAP、TAZ高表達廣泛出現于多種惡性腫瘤中，YAP、TAZ被看作是致癌因子，針對腫瘤中的YAP、TAZ，目前研究YAP、TAZ抑制劑已成為一種必然的趨勢，Li等[12]研究發現在肝星狀細胞中，異甘草酸鎂能通過抑制Hippo通路以達到控制炎癥的作用。楊生輝等[13]通過Western blot、免疫熒光實驗等方法檢測科羅索酸對肺癌細胞株A549中YAP蛋白定量和定位的影響，結果顯示科羅索酸能明顯抑制肺癌細胞株A549中YAP蛋白的表達從而抑制肺癌細胞的增殖并促進其凋亡。開發更加高效特異的YAP、TAZ 抑制劑將對腫瘤的臨床治療提供極大的幫助。

近些年來，對Hippo通路促進腫瘤形成的發生機制的研究越來越多，YAP、TAZ是如何促進腫瘤的形成？綜合國內外的研究發現，在腫瘤中Hippo通路和Wnt/β-catenin通路有密切聯系，共同調節腫瘤的形成。眾多研究表明Wnt/β-catenin是致癌通路，當Wnt信號通路異常活化時會促使腫瘤發生[14]。有研究表明，Hippo通路和Wnt/β-catenin通路在不同的細胞中有不同的相互作用，在心肌細胞中，YAP與β-catenin相互促進調節基因表達，以控制心臟大小、腫瘤細胞的轉化與穩定；而在肝細胞癌中，Wnt/β-catenin通過抑制YAP、TAZ的活性，從而促進腫瘤的發生[15]。溫宗華等[16]研究發現，β-catenin、Survivin在鼻咽癌組織中存在異常表達，且兩者在鼻咽癌的發生發展中起到協同促進作用。本實驗研究發現 β-catenin在鼻咽癌組織中存在細胞漿異常表達，且YAP、TAZ與β-catenin蛋白異位表達成正相關。

本研究結果顯示，YAP、TAZ在鼻咽癌組織的陽性表達率顯著高于非腫瘤鼻咽黏膜組織(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌組織中的異位表達率明顯高于非腫瘤鼻咽黏膜組織(P<0.05)，且YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌組織中的異常表達率與鼻咽癌的病理分型有關(均P<0.05)。8例非角化性分化型癌組織中YAP、TAZ、β-catenin的陽性表達率分別為62.5%、25.0%、37.5%，而92例非角化性未分化型癌組織中YAP、TAZ、β-catenin的陽性表達率分別為93.5%、67.4%、84.8%(均P<0.05)，提示YAP、TAZ、β-catenin可能與鼻咽癌的病理分化過程、發生進展密切相關，這三者在鼻咽癌組織中的異常表達可能導致鼻咽部腫瘤的形成。但由于非角化性分化型癌例數較少，YAP、TAZ、β-catenin的異常表達率與鼻咽癌病理分型呈正相關或負相關，有待進一步研究。TAZ在鼻咽癌中的陽性表達率與5年生存率有關(P<0.05)，提示TAZ蛋白的異常表達與鼻咽癌患者的預后有關，但具體相關性有待進一步行蛋白定量研究。

通過對YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽部組織中的研究，結果提示YAP、TAZ高表達、β-catenin異位表達在鼻咽癌中起致癌作用，給我們提供一個思路，是否可以通過抑制YAP、TAZ蛋白的表達水平、抑制β-catenin的異位表達，用于預防腫瘤的形成、抑制癌組織進一步惡化，或通過檢測YAP、TAZ、β-catenin的表達水平以達到鼻咽癌早期篩查、治療及評估預后的作用。這為鼻咽癌的臨床診斷和治療、為開發YAP、TAZ抑制劑提供了可供參考的理論基礎，為鼻咽癌基因靶向治療藥物開發提供參考的理論依據。