Lon 蛋白酶的研究進(jìn)展

周穎 劉康（通訊作者）

（中國(guó)藥科大學(xué) 江蘇 南京 211198）

1.Lon的結(jié)構(gòu)和功能

Lon 是一種位于線粒體基質(zhì)的蛋白水解酶，也稱(chēng)為L(zhǎng)on 蛋白酶。在細(xì)菌中也稱(chēng)為蛋白酶La，起源于表型缺少Lon 基因的大腸桿菌突變體[1]。在大腸桿菌中，Lon 可降解近50%的異常蛋白質(zhì)。Lon 蛋白酶由核基因編碼，并在所有生物體中高度保守。通過(guò)選擇性降解線粒體基質(zhì)中錯(cuò)誤折疊的蛋白、氧化及短壽命調(diào)節(jié)蛋白參與蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制，維持線粒體基因組的表達(dá)[2]。

線粒體基質(zhì)中有三種蛋白酶屬于AAA+超家族（與多種細(xì)胞活性相關(guān)的ATP 酶），包括m-AAA、CLPXP 和Lon[3]。Lon在胞質(zhì)核糖體中翻譯成具有線粒體靶向序列的前體蛋白形式（MTS），其N(xiāo) 端引導(dǎo)Lon 前體進(jìn)入線粒體基質(zhì)，MTS 裂解后，Lon 轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腖on 蛋白酶，然后重新折疊為有功能的蛋白酶[4]。

Lon 含有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：N 端結(jié)構(gòu)域、ATP 酶結(jié)構(gòu)域（AAA+域）和P 結(jié)構(gòu)域[5]。其N(xiāo) 端結(jié)構(gòu)域可參與底物的識(shí)別，在氨基酸組成上有高度特異性。底物被識(shí)別后發(fā)生去折疊，進(jìn)入蛋白水解部位，則開(kāi)始進(jìn)行肽鍵剪切。有研究發(fā)現(xiàn)Lon 的突變體表現(xiàn)出一系列的N 端結(jié)構(gòu)域缺失，其也失去結(jié)合底物的能力[6]。然而它們?nèi)员３諥TP 酶的活性并可水解較小的多肽。Lon 的N端除了識(shí)別功能外，還參與了自身活性的調(diào)節(jié)。此外，AAA+域可參與ATP 的結(jié)合和水解。P 結(jié)構(gòu)域有蛋白水解活性。

2.Lon和神經(jīng)性疾病

2.1 Lon 和腦缺血/中風(fēng)

在大鼠缺血性腦卒中（大腦中動(dòng)脈栓塞）模型中，Lon mRNA 和蛋白表達(dá)水平由缺血誘導(dǎo)引起，特別是在神經(jīng)元中[7]。已知腦缺氧/血會(huì)引起嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。減少蛋白的合成可用以應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，該途徑需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白激酶PERK 的激活。在PERK（-/-）細(xì)胞中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的Lon 蛋白酶被抑制，證實(shí)了Lon 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[8]。

2.2 Lon 和家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）

ALS 是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，其特征為進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，引起進(jìn)行性麻痹和致命的呼吸衰竭[9]。越來(lái)越多的證據(jù)支持線粒體功能障礙和凋亡激活在ALS 病因中起的關(guān)鍵作用。Lon 下調(diào)導(dǎo)致各種人類(lèi)細(xì)胞元凋亡,由此提出了ALS 中L o n 下調(diào)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡之間存在潛在的直接關(guān)系這一問(wèn)題[10]。

2.3 Lon 和帕金森氏病（PD）

有研究表明，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生和蛋白質(zhì)氧化的線粒體功能障礙可能是導(dǎo)致帕金森氏病發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵。在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的小鼠PD 動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，Lon 在中腦腹側(cè)表達(dá)增加，并伴隨著氧化蛋白的出現(xiàn)和多巴胺能細(xì)胞損失[11]。

3.Lon 與心肌缺血

缺血和缺血性損傷通常會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線粒體損傷。研究表明，線粒體電子傳遞鏈的細(xì)胞色素C 氧化酶(CcO)活性在缺血過(guò)程中遭到破壞，這將破壞線粒體復(fù)合物之間功能聯(lián)系，導(dǎo)致活性氧過(guò)量產(chǎn)生并降低ATP 合成。Naresh B.V. Sepuri1 等研究結(jié)果表明，在缺氧的巨噬細(xì)胞和缺血的兔心臟中，線粒體Lon 的蛋白與mRNA 水平均呈時(shí)間依賴(lài)性增加[12]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Lon 過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)PKA 介導(dǎo)的磷酸化CcO亞基降解，與在缺氧和缺血/再灌注的心臟中觀察到的結(jié)果類(lèi)似[12]。從而證實(shí)Lon 在此過(guò)程中的作用。Lon 活性增加對(duì)于缺氧和心肌缺血再灌注中觀察到的CcO 破壞至關(guān)重要。

4.Lon與胰島素抵抗

線粒體功能紊亂可導(dǎo)致胰島素抵抗和2 型糖尿病。在人肝細(xì)胞中，Lon 下調(diào)會(huì)導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)受阻和糖異生相關(guān)酶水平升高。而Lon 過(guò)表達(dá)能降低由膽固醇和棕櫚酸引起的胰島素抵抗。糖尿病小鼠體內(nèi)的Lon 蛋白水平顯著低于正常小鼠體內(nèi)的Lon 蛋白水平。表明Lon 下調(diào)可能參與胰島素抵抗和2 型糖尿病的進(jìn)程[13]。

5.Lon與癌癥

近年來(lái)Lon 已經(jīng)成為線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)中重要成分，并可作為線粒體改變中的一種重要應(yīng)激傳感器。在許多慢性疾病和癌癥中都可以觀察到這種現(xiàn)象[14]。線粒體L o n 在很多癌癥中過(guò)表達(dá)，如惡性B 細(xì)胞淋巴瘤、宮頸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等[15]。大多數(shù)癌細(xì)胞的主要特征是迅速增殖，會(huì)造成缺氧微環(huán)境，因此線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）由于缺氧被抑制，癌細(xì)胞傾向于依靠糖酵解為其生存和快速分裂提供ATP[16]。越來(lái)越多證據(jù)表明線粒體Lon 參與腫瘤發(fā)生。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物是胞內(nèi)ROS 的主要來(lái)源，ROS 通過(guò)破壞m t R N A、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成線粒體紊亂。對(duì)于癌細(xì)胞，L o n 的上調(diào)可有效去除異常蛋白以確保其線粒體穩(wěn)態(tài)，維持或促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。相反，L o n 下調(diào)能夠降低增殖和代謝。因此，線粒體依賴(lài)的Lon 蛋白酶可作為癌癥診斷的潛在生物標(biāo)志物及抗癌藥物開(kāi)發(fā)新靶點(diǎn)，以預(yù)測(cè)各類(lèi)癌癥化療的效率和效果[17]。

6.Lon與細(xì)胞凋亡

在應(yīng)激狀態(tài)下，Lon 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫、低氧和紫外線輻射下會(huì)使Lon 水平升高從而抑制細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)細(xì)胞存活。而用紫外線處理Lon 過(guò)表達(dá)細(xì)胞和正常細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Lon 過(guò)表達(dá)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞明顯減少，進(jìn)一步確認(rèn)Lon 能保護(hù)細(xì)胞免受紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

線粒體Lon 除降解蛋白作用外，還具有分子伴侶功能。有證據(jù)表明各種應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)p53 轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，并激活凋亡途徑。T-Y Kao 等人通過(guò)免疫共沉淀和免疫熒光共定位反應(yīng)證實(shí)了Lon 和HSP60-mtHSP70 復(fù)合物的相互作用，該復(fù)合物的蛋白穩(wěn)定性取決于氧化應(yīng)激下Lon 的水平。且Lon 抑制細(xì)胞凋亡的能力取決于與p53 結(jié)合的HSP60，表明Lon 調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的機(jī)制是由HSP60-mtHSP70 復(fù)合物的蛋白穩(wěn)定性介導(dǎo)的[18]。Lon 的抗凋亡作用與其促腫瘤作用密切相關(guān)[19]。

7.展望

依賴(lài)ATP 的線粒體Lon 蛋白酶表現(xiàn)出很多線粒體功能調(diào)節(jié)作用，包括降解異常蛋白，維持mtDNA 完整性和生物能代謝。Lon 對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起著重要作用，其對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)尤為受到關(guān)注。至今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Lon 蛋白酶的特異性抑制劑，但有幾種蛋白酶體抑制劑，包括廣泛使用的20S 蛋白酶體抑制劑MG132 可擴(kuò)散到線粒體中并抑制線粒體類(lèi)固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）的表達(dá)，后者是Lon 蛋白酶的內(nèi)源性底物，提示蛋白酶體和Lon 蛋白酶在蛋白水解機(jī)制上可能有相似之處。今后基于Lon 蛋白酶的高通量藥物篩選模型的建立以及從天然產(chǎn)物和合成小分子化合物庫(kù)中尋找Lon 蛋白酶特異性抑制劑和激活劑,無(wú)疑會(huì)加快Lon 蛋白酶作用分子機(jī)制的全面和深入研究,并將促進(jìn)相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)[20]。