乳酸菌的分離鑒定方法及益生功能應用研究

楊曉萍，陳梓琦，鐘先鋒

（佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東 佛山 528000）

乳酸菌分布于自然界中，常發現于植物、動物中，在食品、泥土及河流湖泊等也有發現，是自然界中普遍存在的細菌。乳酸菌應用的歷史悠久，《齊民要術》中記錄的咸肉、肉醬及甜醬菜便有乳酸菌的參與。大量研究證明，乳酸菌具有多種重要功能，如降低膽固醇、抗氧化、抑菌、耐藥性、降亞硝酸鹽等作用。闡述乳酸菌概況、分離鑒定方法、益生功能和主要應用領域進展，為乳酸菌的深入研究應用提供一定的理論基礎及參考。

1 乳酸菌概述

乳酸菌是一群通過碳水化合物，在代謝過程中發酵產生乳酸的革蘭氏陽性、無芽孢且厭氧的細菌總稱[1]。從分類上看，形態上可分成球菌和桿菌。球形乳酸菌包括糖球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌；桿狀菌包括肉食桿菌屬、乳桿菌、雙歧桿菌等；從來源上分，大致可分為植物源乳酸菌和動物源乳酸菌[2]。從發酵類型上看，可分成同型發酵和異型發酵[3]。乳酸菌有18個屬，其中鏈球菌屬和乳桿菌屬是最主要的2個屬。隨著食品生物技術的發展，科學家對乳酸菌的研究越來越關注在重要應用功能及潛在經濟價值上。同時，人們也不斷注重乳酸菌在食品工業、飼料工業及醫療領域中的開發和應用[4-5]。

2 乳酸菌的分類鑒定方法

2.1 表型鑒定法

表型特征鑒定方法主要包括抗菌譜試驗分類法、化學分類法、雙歧桿菌的酶學鑒定法、形態學觀察與生理生化特征鑒定法[6]。形態學觀察和生理生化鑒定是最關鍵也是最常用的菌種分類與鑒定環節。形態學觀察主要是觀察菌株菌落形態及菌體形狀，如菌落的大小、顏色、凸起狀況、菌體是否有鞭毛和芽孢等。隨著近年來糖類生化反應板的研制成功，生化鑒定已由繁變簡，并大范圍推廣使用，其中API系統是種類最多且運用范圍最廣泛的細菌快速分類系統。此外，還可利用抗菌譜試驗及酶系鑒定等方法鑒定乳酸菌?？咕V試驗的原理是根據不同乳酸菌抗菌譜和抗菌劑敏感度的差異性，對乳酸菌作出相應分類[7]。化學分類法則是通過測定乳酸菌的代謝產物及菌體組分來鑒定菌種[8]。雙歧桿菌的鑒定可利用酶學鑒定法。雙歧桿菌代謝產生果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶 （Furctose-6-phosphatephosph-oketolase，F6PPK），細胞在超聲破碎后，游離的F6PPK可使果糖-6-磷酸鹽生成乙酞磷酸鹽，后者和FeCl3相結合為氧酸鹽，產物顯紅褐色或紅紫色，借此鑒定雙歧桿菌。

2.2 基于16S rRNA基因序列分析的分子生物學鑒定方法

研究表明，原核生物有3種rRNA，分別是23S rRNA，16S rRNA，5S rRNA。16S rRNA位在于所有原核生物中，功能與結構都具有極大的“保守性”，被稱為“細菌活化石”[9]。16S rRNA的核苷酸數量大小約1 500 bp，大小較合適，同時含有相對可變區域與高度保守區域，根據相對可變區域可揭示細菌菌種的差異性，根據保守區域的同源性分析可知菌種之間的親緣關系[10]。因此，通過對16S rRNA基因保守區域和可變區域的比對可確定其系統進化關系。使用細菌通用正向引物27F和反向引物1492R，以細菌基因組為模板，適當條件下進行聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），產物檢驗合格后進行測定序列，通過比對獲得的序列信息與數據庫中同源性相近的基因序列信息，確定菌株的系統進化地位[11]。目前，常結合形態學、生理生化試驗與16S rRNA基因測序分析方法對細菌進行分類鑒定。

2.3 應用于乳酸菌鑒定的其他分子生物學技術

由于核酸測序技術不斷發展，多種分子生物學技術廣泛應用于乳酸菌的快速鑒定，應用較多的有DNA的G+C含量測定法、DNA-DNA同源性（或雜交）分析法、DNA指紋圖譜技術等技術[12]。

自然界中，每種生物DNA中G（鳥嘌呤） +C（胞嘧啶）含量是特定的。因此，細菌DNA中（G+C）摩爾分數值被認為是細菌的一個普遍遺傳特征，并使用DNA（G+C） mol%表示。研究表明，細菌種間的DNA（G+C）mol%小于5 mol%，同屬細菌的則不大于12 mol%；原核微生物的DNA（G+C） mol%值為 20～80 mol%，真核微生物的為 30～60 mol%[13]。

微生物的基因組在進化過程中會逐漸改變。DNA-DNA同源性分析法或雜交法主要是依據微生物DNA核苷酸序列的雜交程度或互補程度來判斷細菌與細菌間基因型的相似性，進而推斷細菌的遺傳進化關系[14]。試驗證明，DNA-DNA同源性分析法能夠區分生理生化試驗不易區分的細菌[12]。

DNA指紋圖譜技術（DNA finerprintin gtechnique） 主要有基于基因組重復序列的PCR技術（Repetitive Extragenic Palindromic PCR，REP-PCR）、基因組DNA限制性片段長度多態性分析（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、變性梯度凝膠電泳 （Denatured gradient gel ectrophoresis，DGGE）和隨機擴增多態性DNA技術（Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD） 4 種[12]。REP-PCR 技術應用普遍，首先需擴增細菌DNA中分布最廣的短重復序列，凝膠電泳并觀察產物條帶，其不同分布表明不同細菌的DNA差異性。該方法操作簡單，可大樣本量進行。RFLP方法使用限制性內切核酸酶將細菌全基因組DNA進行酶切，根據酶切片段長度的多樣性鑒定細菌種屬[15]。DGGE方法是利用DNA中核酸的不同堿基變性溫度不同，通過不同的電泳條件，將堿基排列順序不同的DNA片段分開[16]。RAPD方法是利用大小約為10 bp的小寡核苷酸引物，使之在較低退火溫度下，與其同源性最高的DNA序列結合，產物進行PCR擴增，電泳后觀察圖譜，根據圖譜的多態性鑒定微生物[17-18]。

3 乳酸菌的功能

3.1 降低膽固醇作用

某些乳酸菌株能夠降低體內膽固醇含量，長時間食用含乳酸菌的食品或乳酸菌發酵食品可在一定程度上降低血液中的膽固醇含量，從而有效降低心血管疾病的發病率[19]。馬長路等人[20]從傳統東北酸菜中分離篩選出的MHS1701，MHS1703，MHS1706乳酸菌株的膽固醇清除能力分別達41%，53%，41%。吳海珍等人[21]用高膽固醇質量濃度（1.0 mg/mL） 從18株乳酸菌中分離出膽固醇清除率最高為41.50%的JY20菌株。孫博瑞[22]利用OPA法測定出10株乳酸菌中降膽固醇能力較穩定的為屎腸球菌GU983697。任大勇等人[23]篩選得到6株高膽固醇清除能力的菌株C1，C2，H6，H9，L22，L30，清除率均在85%以上。

3.2 抗氧化作用

乳酸菌作為天然食品添加劑能緩解機體氧化應激，預防某些疾病。Zhao D，Furumoto H等人[24-25]試驗發現某些乳酸菌能夠清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、羥自由基等活性氧自由基從而緩解細胞氧化應激。吳石金等人[26]分離出1株具有優良抗氧化性的短乳桿菌ZJ401。肖宇等人[27]從藏靈菇中分離出8株抗氧化能力優良的菌株發酵乳。王帥等人[28]在泡菜中分離得到2株（Kc6，Kc13） 具有高抗氧化性功能的乳酸菌菌株。高暢等人[29]通過研究發現富硒乳酸菌中藥制劑可以大大提高育肥豬免疫能力和血清及組織的抗氧化能力。

3.3 抑菌作用

一些乳酸菌的代謝產物具有抑菌作用。梁曉明等人[30]試驗發現副干酪乳酸菌S-4產生的有機酸對4株致病弧菌均具有顯著的抑制作用。朱建寧等人[31]從牦牛曲拉分離出6株乳酸菌，發現菌株Q2對大腸桿菌的抑菌能力最強。陳凱等人[32]發現乳酸菌S60和S72對水產動物常見病原菌嗜水氣單胞菌等均有抑制作用，其有效抑菌物質與有機酸類相關。吳愛娟等人[33]從傳統酸奶篩選出的1株植物乳桿菌B6所產生的Ⅱb類細菌素具有廣譜抑菌性。

3.4 耐藥性作用

乳酸菌可由自身基因突變獲得耐藥基因或從外界得到耐藥基因，從而具有耐藥的功能。呂耀龍等人[34]研究發現，內蒙古達茂旗牧區牛乳中乳酸菌菌株DM21對部分抗菌藥物具有較高的耐藥性，其耐藥性與gyrA基因突變有關。王海清等人[35]研究發現，保加利亞乳酸桿菌（L.bulgaricus） 和嗜熱鏈球菌（S.thermophilus） 對氨芐青霉素表現耐藥性。黨喬等人[36]在泡菜分離得到的34株乳酸菌對氨芐西林和氯霉素敏感。Yuksekdag Z H等人[37]分離出的24株乳酸菌對氨芐西林耐藥率為56%。Aslim B等人[38]試驗研究發現34株嗜熱鏈球菌（S.thermophilus） 對青霉素的耐藥率為64%。

3.5 降亞硝酸鹽作用

乳酸菌在食品發酵中表現出良好的降解亞硝酸鹽功能。Fei Y等人[39]研究驗證乳酸菌代謝產物亞硝酸還原酶及乳酸，可降解、清除亞硝酸鹽。卿煜維等人[40]發現德氏乳桿菌在發酵罐恒定pH值6.0、培養24 h的亞硝酸鹽降解率為98.9%。程方方等人[41]從辣椒醬分離出1株腸膜明串珠菌（Leuconostocmes enteroides），其亞硝酸鹽降解率達88.91%。張興吉等人[42]通過從西部牧區傳統發酵乳品篩選得到的275株乳酸菌的試驗發現，其中50%的乳酸菌亞硝酸鹽降解率平均在91.3%以上。

4 乳酸菌的應用現狀

4.1 乳酸菌在食品領域的應用

在食品領域抗生素泛濫的現狀下，被認為安全、有效、無毒的乳酸菌逐漸成為學者們的研究熱點，并廣泛應用于肉制品、奶制品、蔬果制品及其他食品的生產。劉佳秀等人[43]從海洋魚類中分離得到植物乳桿菌Y12，以單獨接種與混合接種的方式接種于黃花魚魚肉，進行揮發性鹽基氮測定及感官評分。結果表明，Y12具有良好的抑菌效果，可用于魚肉保鮮。許女等人[44]將抗氧化活性強、產香及產黏效果好的凝結芽孢桿菌Z10和植物乳桿菌Z4應用于酸奶的生產制作，試驗發現酸奶成品的抗氧化性增強、穩定性提高、凝乳的質地得到極大改善。鄒華軍等人[45]研究結果表明，乳酸菌發酵泡菜中過程中，試驗組泡菜的亞硝酸鹽峰值較傳統泡菜的提前2 d出現，且峰值大小僅為傳統泡菜的20%；乳酸菌能有效提高泡菜產品的安全性及縮短泡菜的生產周期。張夢寒[46]研究解淀粉芽孢桿菌JY06與其突變株E6、C12對醬油發酵過程中氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC，致癌物質）及其前體物瓜氨酸的降解效果，試驗發現突變株E6與C12利用精氨酸的能力均高于JY06，且醬油產品中瓜氨酸分別下降14.7%和15.6%，氨基甲酸乙酯分別下降13.1%和19.3%。

4.2 乳酸菌在飼料領域的應用

禽畜的飼養離不開飼料，飼料含有畜禽所需的營養成分，能夠促進畜禽的健康成長，縮短出欄期，提高農戶的經濟效益。侯鵬霞等人[47]研究全株玉米與新鮮馬鈴薯秧作為青貯原料在不同條件下處理的品質變化，結果表明馬鈴薯秧的添加量為20%～40%時，添加乳酸菌能降低飼料中龍葵素的含量，飼料的安全性與適口性更好。蔡義民等人[48]研究乳酸菌發酵劑對非洲產甘蔗秸稈及玉米秸稈混合發酵青貯飼料發酵品質的影響，發現添加乳酸菌后，飼料原料的營養無明顯損失，飼料的發酵品質得以改善。劉鳳美等人[49]研究發現，飼料中添加枯草芽孢桿菌、乳酸菌混合制劑，能促進肉雞免疫器官健康發育，進一步提高肉雞的免疫力和抗病能力。

4.3 乳酸菌在醫藥領域的應用

隨著人們對乳酸菌功能特性研究的深入，越來越多益生乳酸菌被應用于醫藥領域。王林康等人[50]研究乳酸菌發酵中草藥對產后母豬的臨床效果，結果發現，大青葉、黃芪、蒲公英等藥材經乳酸菌發酵，能夠有效縮短母豬排惡露的時長，降低母豬宮內膜炎的患病幾率，增加仔豬斷奶體重。林晨輝[51]進行中藥聯合益生菌治療慢性腹瀉的臨床研究，試驗表明中藥聯合混合乳酸菌制劑能夠有效治療慢性腹瀉，無副作用，優于西藥治療。王亮亮[52]對乳酸菌預防奶牛乳腺炎的機制進行了研究，試驗表明，源于健康奶牛的3株益生乳酸菌，均能抑制金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺上皮細胞的感染、黏附及定植，最終達到預防或減輕奶牛乳腺炎感染的目的。

5 結論

隨著食品工業科技的不斷發展和人們對健康關注度的提升，從發酵類食品中分離鑒定乳酸菌的技術方法不斷改進，更加高效準確。乳酸菌安全性和益生特性已得到廣泛公認，具有廣闊的開發和應用前景。在科研人員對乳酸菌益生功能的不斷開發與研究下，乳酸菌能夠在未來給人類健康和社會發展帶來更大益處。