三七對急性腦缺血/再灌注損傷大鼠神經血管單元的整體保護作用研究

梁 萍，黃 清，農立宇，林 軍，劉 蕾，蒙蘭青,3

(1.右江民族醫學院桂西地區高發病防治研究重點實驗室，廣西 百色 533000；2.廣東醫科大學附屬第二醫院神經內科，廣東 湛江 524000；3.右江民族醫學院附屬醫院神經內科，廣西 百色 533000)

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是由缺血缺氧性腦組織壞死導致神經功能缺失癥狀的一種疾病，約占全球死亡總數的11%[1]。腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是IS重要的級聯反應過程，涉及多個病變機制，最終導致神經元等多種腦細胞凋亡、壞死[2]。 “神經血管單元(neurovascular unit， NVU)”作為IS的整體救治模型，旨在挽救包含神經元、星形膠質細胞、微血管內皮細胞在內的缺血腦組織[3]。隨著醫學水平的提高和中藥整體觀的認可，人們發現被譽為“人參之王”的三七(PanaxNotoginseng，PN)在CIRI治療過程發揮了較大的作用。PN是五加科人參屬草本植物，含有多種活性成分，可通過抑制CIRI后多個病理生理環節[4-5]，促進腦缺血后NVU組分的修復[6]，發揮明顯的抗CIRI作用。但目前，三七總皂苷(PanaxNotoginsengSaponins，PNS)(PN的有效活性成分之一)在臨床中IS的治療更加常見。將PN整體活性成分用于CIRI的治療是一個新的探索。本研究中，通過觀察大鼠神經行為學表現、腦梗死體積百分比、NVU超微結構變化，同時測定氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation and reperfusion，OGD/R)后，細胞共培養模型中的4 h滲漏及細胞凋亡率，進一步評價PN對腦缺血后NVU的保護作用，也為將PN開發成一種治療IS的多靶點保護藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD♂大鼠100只，體質量(250±30)g，制作MCAO大鼠模型。2 ∶1雌雄比例的大鼠共15只，體質量(300±30)g，用來繁殖新生幼鼠。大鼠均購自湖南長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號為SCXK(湘)2014-0011。實驗過程嚴格按照《中國實驗動物使用和管理辦法》執行。

1.2 藥品三七粉，購自文山市苗鄉三七實業有限公司，執行標準：《中國藥典》2015年版一部，產品批號:C20180803。稱取一定量三七粉，將其用生理鹽水稀釋配成終濃度為5、10、15 g·L-1的溶液灌胃。

1.3 主要試劑與耗材4%多聚甲醛(貨號：P110)、氯化2，3，5三苯基四氮唑(TTC，貨號：G3005)、含EDTA胰蛋白酶(貨號：T1300)、不含EDTA胰蛋白酶(貨號：T1350)、10×多聚賴氨酸(貨號：P2100)、PBS(貨號：P1020)、細胞培養瓶(貨號：30710126，156499)、15 mL離心管(貨號：430790)、0.22滅菌濾器(貨號：SLGP033RB)均購自Solarbio公司；電鏡固定液(貨號：G1102)購自Servicebio公司； 812包埋劑(貨號：90529-77-4)購自SPI公司；胎牛血清(貨號：A3161002)、DMEM無糖培養基(貨號：C1995500BT)、DMEM含糖培養基(貨號：C11995500BT)購自Gibco公司；PET膜 Transwell 透明嵌套(0.4 μm,貨號：3450)購自Corning公司；100～1 000 μL槍頭(貨號：CS015)購自Excell Bio公司；大鼠皮質神經元細胞完全培養(貨號: CM-R105)、大鼠神經星形膠質細胞完全培養基(貨號: CM-R137)、大鼠腦微血管內皮細胞完全培養基(貨號: CM-R108)購自Procell公司；濃縮型正常山羊血清(貨號: AR1009)、熒光(Cy3)標記羊抗兔 IgG(貨號: BA1032)購自BOSTER公司；TritonX-100(貨號: ST795)、DAPI(貨號: C1002)購自碧云天公司；β-tubulin(種屬：兔，貨號:10094-1-AP)、GFAP(種屬：兔，貨號: 16825-1-AP)購自Proteintech公司；CD31(種屬：兔，貨號: ab222783)購自Abcam公司；BD凋亡試劑盒(貨號: 556547)購自BD Pharmingen公司。

1.4 主要儀器Leica UC7型超薄切片機購自Leica公司；Ultra 45°型鉆石切片刀購自Daitome公司；HT7700型透射電子顯微鏡購自HITACHI公司；MDF-U72V(-80 ℃)超低溫冰箱購自日本三洋公司；Eppendorf research plus 移液槍購自德國eppendorf 公司；BS/BT223S電子天平購自北京賽多利斯科學儀器有限公司；DZG-303A純水機購自上海愛莫電氣科技有限公司；MIC101厭氧箱(含雙流量計、氧電極)購自北京久易科儀科技有限公司；CO2培養箱購自SANYO公司；倒置相差顯微鏡購自OLYMPUS公司；流式細胞儀購自Becton Dickinson公司；臺式離心機購自湘儀離心機儀器有限公司；熒光顯微鏡購自奧林巴斯BX53公司。

1.5 在體實驗

1.5.1大鼠CIRI模型的分組、制作 將符合實驗條件的大鼠隨機分為假手術組(Sham)、動物模型組(CIRI)和三七組(PN)。PN組又分為50、100、150 mg·kg-1三個劑量組。每組10個大鼠。CIRI組和PN組大鼠參照課題組前期實驗造模方法制作大鼠局灶性大腦中動脈閉塞模型[6]，即大鼠實驗線栓進入右側頸內動脈約18～19 mm。假手術組線栓插入頸內動脈深度為8～10 mm，未造成腦缺血。缺血2 h后緩慢拔出栓線約1 cm，使Willis環血流通暢、右側大腦中動脈恢復血供，完成腦缺血/再灌注損傷，剪掉暴露在術口外的線栓。

1.5.2選取造模成功的大鼠 CIRI后2 h分別根據Longa 5級神經功能評分標準對各組大鼠進行神經功能行為學評分。評分1～3分的大鼠繼續下一步實驗。

1.5.3動物模型的給藥 PN組內每個劑量組大鼠在CIRI 1～2 h后分別根據大鼠體重取適當的三七粉，分別給予已配好的三七溶液灌胃。從低到高劑量組分別對應的三七溶液濃度是5、10、15 g·L-1。首日1次，之后每天2次。Sham、CIRI組大鼠在相同的時間點給予等量生理鹽水灌胃。術后干預7 d。其余組術后不予處理。

1.5.4大鼠用藥后神經功能學再評分 CIRI后7 d再采用Longa 5級評分法進行各只大鼠的行為學評分。

1.5.5大鼠腦梗死體積比的測定 7 d后，每組取3只大鼠腹腔注射麻醉取腦，切成2 mm厚片。適當的2% TTC染液、37 ℃恒溫水浴箱對腦切片進行避光染色，每10 min翻動1次。染色時長30 min。腦片經終止染色、固定24 h后拍照。Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

1.5.6CIRI后大鼠NVU超微結構的觀察 干預7 d后的相應時間點對3組大鼠神經功能缺損評分后腹腔麻醉、心臟放血、斷頭取材，取缺血灶周邊腦組織、剪成小于1 mm3，漂洗(生理鹽水)、室溫固定(3%戊二醛，2 h)、4 ℃固定(3%戊二醛，2 h以上)、漂洗(0.1 mol PBS，3次，45 min)、固定(1%鍔酸，2 h)、酒精脫水(50%、70%、80%、90%、95%各15 min)、包埋(Epon812)、超薄切片(片厚60 nm)、染色(2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛)，在透射電鏡下采集圖像分析。

1.6 離體實驗

1.6.1三種原代細胞的培養 參照文獻報道所述方法[7-8]，仔細分離大腦皮層組織，經過清洗、消化、吹打、過濾、離心、重懸等步驟后接種于培養瓶中(除神經元外，其他無需多聚賴氨酸提前包被),于CO2孵箱中正常培養。皮層神經元培養24 h后向培養液內加入阿糖胞苷(5 μmol·L-1)抑制非神經細胞生長。48 h后均更換培養基，以后每3 d換液1次，直至細胞長滿。

1.6.2細胞形態觀察及免疫熒光鑒定 倒置顯微鏡下對各組細胞進行形態觀察后，采用免疫熒光技術分別對神經元β-Tubulin、星形膠質細胞GFAP和微血管內皮細胞CD31進行檢測，經爬片、固定、室溫通透、浸洗、封閉、雙抗體孵育、復染、封片等操作后置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6.3NVU體外模型構建 根據實驗要求將純化培養的單細胞一起培養于Transwell內。首先將Transwell插入池翻轉至無菌飯盒中，將傳代至第3代的星形膠質細胞種植到插入池的外側面(1.5×105cells·cm-2)，等待4 h至星形膠質細胞貼壁后，將Transwell插入池轉入六孔板中；2 d后將成熟的腦微血管內皮細胞種植到Transwell插入池內池(1.0×105cells·cm-2)，與星形膠質細胞共培養2 d；將共培養的Transwell 插入池放置于已生長2-3 d左右的神經元培養孔中(0.5×105cells·cm-2)，共培養3-4 d；即建成體外NVU共培養模型。

1.6.44 h滲漏實驗[9]細胞共培養3～4 d后，在Transwell池內加滿培養液,使六孔板內的培養液液面加至低于Transwell池液面0.5 cm處,培養箱中正常培養4 h后觀察液面變化。若液面無明顯降低，則造模成功。

1.6.5含藥血清制作 大鼠腦缺血/再灌注7 d，末次給藥1 h后取CIRI組、PN不同劑量組各6只大鼠，分別收集相應組別的血液。參照文獻所述方法進行處理血制品[9]，最終得到空白血清和PN不同劑量組含藥血清。

1.6.6OGD/R模型制作、分組及給藥 將成功造模的NVU模型隨機分為對照組(Control)、細胞模型組(OGD/R)以及對應在體實驗不同劑量的三七含藥血清組(PN drug serum，PNDS)。OGD/R組、PNDS組制作OGD/R模型，即缺血缺糖培養基置換含糖含血清培養基，然后放入37 ℃、95% N2和5% CO2混合氣缺氧裝置中進行OGD 2 h；2 h后，OGD/R組予更換DMEM含糖培養基時，加入10%的空白血清；PNDS組分別于更換DMEM含糖培養基時加入10%對應濃度的含藥血清；Control組不作OGD/R處理，但同樣更換含10%空白血清的DMEM含糖培養基；37 ℃的CO2培養箱內復氧24 h，最終完成OGD/R模型制作。

1.6.74 h滲漏實驗 復氧20 h時進行，方法同“1.6.4”。

1.6.8細胞凋亡率檢測 各組細胞于OGD/R 24 h后經消化、沖洗，并按照試劑盒步驟操作，流式細胞儀上機。單染組校正電壓。

2 結果

2.1 三七對CIRI大鼠神經功能缺損評分的影響Sham組大鼠無神經缺損癥狀，評分為0；CIRI 2 h評分顯示，PN組、CIRI組大鼠評分無明顯差異。CIRI 7 d評分顯示，與Sham組相比，CIRI組出現不同程度的神經功能缺損癥狀，評分有明顯升高(P<0.01)；與CIRI組相比，PN組大鼠神經功能缺損評分明顯改善(P<0.01)。見Tab 1。

2.2 TTC染色對各組大鼠腦梗死體積的影響如Fig 1所示，Sham組未見梗死灶，腦梗死體積為0；與Sham組相比，CIRI組出現明顯腦梗死灶，差異顯著(P<0.01)；與CIRI組相比，PN各劑量組腦梗死體積明顯縮小(P<0.01)。見Fig 2。

2.3 各組大鼠腦細胞透射電鏡下的超微結構變化

2.3.1各組大鼠神經元電鏡下形態學變化 Sham組(N1)細胞結構較清晰，部分細胞器稍擴張，但細胞整體狀態良好。CIRI組(N2)細胞膜破裂，核周片狀溶解、水腫，細胞器流失；核皺縮；現存線粒體結構模糊伴腫脹擴張。PN組(N3、N4、N5)細胞周圍無明顯水腫；細胞核無明顯皺縮，染色質分布較均勻；細胞器結構尚清晰可見，但仍有部分細胞器腫脹明顯。PN減輕了腦缺血引起的細胞超微結構損傷，同時間點觀察細胞器結構狀態發現相對于CIRI組較好, 如Fig 3。

2.3.27組大鼠星形膠質細胞電鏡下形態學變化 Sham組(A1)細胞膜結構完整；出現染色質碎裂現象；部分細胞器輕度微擴張；但整體無明顯異常改變。CIRI組(A2)細胞明顯呈空洞樣改變；細胞核異型改變，核內可出現空洞；細胞器明顯擴張，高爾基體板層結構消失，細胞器內大量空泡形成；細胞整體狀態不佳。50 mg·kg-1PN組(A3)仍可見腫脹空泡樣細胞器改變，但較CIRI組相比異常改變略微減輕。100 mg·kg-1PN組(A4)細胞外形較不規則，周圍輕度水腫；細胞核皺縮，染色質邊集；大部分細胞器中度腫脹呈空泡樣。150 mg·kg-1PN組(A5)細胞水腫、核皺縮、染色質改變及細胞器結構方面評價細胞狀態，發現PN組減輕了腦缺血引起的細胞超微結構損傷，同時間點觀察細胞結構狀態相對于CIRI組較好，見Fig 3。

Tab 1 Effect of Panax Notoginseng on neurological function and behavior scores in each group of

Fig 1 Photographs of brain sections with TTC staining

Fig 2 Effects of Panax Notoginseng on cerebral infarction volume in different groups of

2.3.3各組大鼠微血管電鏡下形態學變化 Sham組(B1)內皮細胞周圍連接緊密；微血管管腔通暢；細胞器結構模糊；CIRI組(B2)內皮細胞周圍出現嚴重的水腫；微血管管腔狹窄嚴重；細胞核異型改變，細胞器結構模糊；PN組仍可觀察到細胞核異型性改變，但總體而言，PN組在微血管管腔、細胞連接方面較CIRI組均有所減輕。見Fig 3。

2.4 細胞免疫學熒光鑒定① 神經元β-Tubulin：圖中(Fig 4)紅色熒光為β-Tubulin陽性，陽性率>90%，即：細胞純度>90%。② 星形膠質細胞GFAP：圖中(Fig 5)紅色熒光為GFAP 陽性，陽性率>90%，即：細胞純度>90%。③ 微血管內皮細胞CD31：圖中(Fig 6)紅色熒光為CD31陽性，陽性率>90%，即：細胞純度>90%。

2.5 PN對NVU共培養模型屏障功能的影響如Tab 2所示，與Control組對比，OGD/R組transwell池內液面明顯下降(P<0.01)；經PN含藥血清干預后的PNDS組液面無明顯下降，與OGD/R組相比差異較明顯(P<0.01)。

2.6 PN對NVU共培養模型細胞凋亡的影響Fig 7、Fig 8分別顯示了各組共培養模型經OGD/R處理后的神經元及腦微血管內皮細胞凋亡情況。結果顯示， OGD/R組神經元、腦微血管內皮細胞凋亡率較Control組明顯增加(P<0.01)，PN含藥血清干預后的PNDS組神經元、腦微血管內皮細胞凋亡率有明顯下降(P<0.01)。

3 討論

CIRI是由NVU組分共同參與的級聯反應過程。腦微血管內皮細胞在CIRI作用下受損，進一步導致的血管痙攣及繼發的血管通透性增高加劇腦缺血所致的缺血缺氧損傷；腦缺血早期的逐層放大效應可逐漸累及血管周邊的星形膠質細胞，當血腦屏障被破壞，外周有害代謝物質侵入并破壞大腦的微環境；繼而凋亡的星形膠質細胞在CIRI早期分泌興奮性神經遞質和炎癥因子破壞周圍的神經元。這一系列復雜的細胞、分子和代謝事件，歸咎于CIRI發生后的能量代謝障礙、鈣超載、自由基連鎖反應以及細胞凋亡等過程[9-10]。各個病理過程相互重疊、相互聯系、相互加強，導致不可逆的腦損傷。隨著IS病程的進展，神經血管病變加重，腦缺血灶增大。同時，缺血性腦損傷破壞血腦屏障，繼而引發一系列事件，導致腦水腫形成、出血轉化和繼發性神經功能不良[11]。臨床上，有超過1/3的腦卒中患者發生腦血腦屏障破壞，并且與IS后的不良預后和較低的生存率密切相關。神經元保護是目前臨床上腦組織保護的主要手段，但是由于治療靶點的單一性以及缺血損傷過程的不可逆性，其治療作用甚微[12]。神經血管單元強調了NVU整體保護的重要性。為此有些研究者提出了CIRI的雞尾酒療法[13]，如鈣離子拮抗劑和自由基清除劑的聯合用藥，以針對CIRI不同的發病過程或不同的細胞靶點；多種藥物合用，一方面有助于IS患者神經功能的恢復，縮短住院時間，但是另一方面可能增加了臨床藥物使用的毒副作用，并且極大地增加了人們的負擔。

Tab 2 Effects of diverse drug serum on 4 h leakage level difference in NVU co-culture

Fig 3 Ultrastructure of NVU in each group of rats

Fig 4 β-Tubulin of immunofluorescence in neurons(×200)

Fig 5 GFAP of immunofluorescence in astrocytes(×200)

Fig 6 CD31 of immunofluorescence in cerebral microvascular endothelial cells(×200)

Fig 7 Effects of Panax Notoginseng drug serum on neuronal

Fig 8 Effects of Panax Notoginseng drug serum on apoptosis of cerebral microvascular endothelial cells after vs control;**P<0.01 vs OGD/R.

PN治療靶點多且不良反應少，具有傳統中醫藥的優勢，與CIRI的后的NVU整體治療靶點相契合。研究證實，PN可通過抑制細胞內鈣超載[14]、抗炎[15]、抑制細胞凋亡[16]及降低血腦屏障通透性[17]等方面作用于CIRI中多個病理過程，促進神經系統功能恢復，對腦缺血損傷有確切療效。我們的研究表明，在大鼠CIRI后1～2 h開始給予PN溶液灌胃，可以顯著降低大鼠神經功能評分，減少皮層和皮層下梗死體積，以及減輕NVU主要結構損害，從而促進大鼠的神經行為恢復。同樣，OGD/R細胞模型進行氧糖剝奪2 h，經過PN含藥血清24 h干預的細胞凋亡率明顯降低，而且Transwell池內滲漏液面無明顯下降，提示PN在促進神經元、微血管內皮細胞的存活，并降低屏障的通透性方面發揮了重要的作用。表明PN作用于CIRI的機制之一可能是同時抑制NVU多種細胞凋亡，對NVU具有整體保護作用。本課題組將繼續深入研究PN如何多途徑作用于腦缺血/再灌注損傷。