基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究補(bǔ)陽還五湯防治動脈粥樣硬化的作用機(jī)制

魏亞男，朱博冉，姬夢姣，周 童，翟 意，薛文達(dá)，陶偉偉，陳 剛，王 薇，吳顥昕

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院中醫(yī)腦病重點實驗室，南京 210023；2.暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院腦病個性化防治跨學(xué)科研究所，廣州 510632；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院整合醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性動脈壁疾病，涉及泡沫細(xì)胞的產(chǎn)生，細(xì)胞外脂質(zhì)的積累，斑塊的形成以及最終斑塊的破裂[1]。當(dāng)今，動脈粥樣硬化性心血管疾病是主要的死亡原因[2]?；谒☆愃幬锏囊幌盗胁涣挤磻?yīng)[3]，開發(fā)更有效的治療策略以改善AS患者的根治性治療并減少副作用的發(fā)生意義重大。補(bǔ)陽還五湯出自清代名醫(yī)張錫純的《醫(yī)林改錯》，由黃芪、川芎、當(dāng)歸、赤芍、桃仁、紅花、地龍等7味中藥組成,是補(bǔ)氣活血的代表方劑?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯具有抑制炎癥反應(yīng),降低血脂,穩(wěn)定動脈斑塊的作用[4]。董捷鳴等建立了補(bǔ)陽還五湯HPLC指紋圖譜,標(biāo)記了23個共有峰[5]，初步探索了該配方的生物活性成分。但對于多成分多靶點的補(bǔ)陽還五湯在防治AS的復(fù)雜機(jī)制方面研究并沒有結(jié)束。

隨著計算機(jī)技術(shù)與數(shù)據(jù)庫技術(shù)的不斷成熟，中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建的各種復(fù)雜成分的分子網(wǎng)絡(luò)以及基于多級靶標(biāo)的蛋白質(zhì)和基因相互作用，可以闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)和功能[6]。中醫(yī)方劑的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析正成為研究由高脂血癥和AS等復(fù)雜多樣的因素表現(xiàn)出來的疾病的一種重要研究方法。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺探究補(bǔ)陽還五湯治療AS的作用機(jī)制,首先有利于解決物質(zhì)基礎(chǔ)篩選時造成的高昂的成本及長周期的問題,其次也有助于解決探尋補(bǔ)陽還五湯防治機(jī)制時出現(xiàn)的單靶作用局限性問題。

1 材料

1.1 補(bǔ)陽還五湯的化學(xué)成分來源補(bǔ)陽還五湯各中藥的化學(xué)成分收集自中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，TCMSP收錄了大量中草藥數(shù)據(jù)，對每種藥物的成分、分子名稱、分子量、人類口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)、半衰期和血腦屏障等進(jìn)行了描述。由于目前TCMSP數(shù)據(jù)庫中暫未收錄地龍的成分，因此我們從TCMID (http://bidd.nus.edu.sg/group/tcmsite/query.aspx)數(shù)據(jù)庫收集地龍的化學(xué)成分。設(shè)定OB≥30% 和 DL≥0.18，篩選出符合條件的化合物進(jìn)行分析。但由于這種篩選剔除了很多不符合條件的但卻有廣泛藥理學(xué)作用的化合物，如黃芪甲苷、阿魏酸、紅花黃色素等。為了提高預(yù)測結(jié)果可信度，進(jìn)一步通過相關(guān)文獻(xiàn)收集補(bǔ)陽還五湯的化學(xué)成分。并利用 Pub Chem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)確證其分子結(jié)構(gòu)及名稱，保存其sdf 格式，建立補(bǔ)陽還五湯的化合物數(shù)據(jù)庫。

1.2 化合物靶點的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)，基于 Drug Bank 數(shù)據(jù)庫，利用化學(xué)信息學(xué)對補(bǔ)陽還五湯所含藥物靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測。檢索補(bǔ)陽還五湯相關(guān)化合物，化合物對應(yīng)的靶標(biāo)，從而實現(xiàn)對補(bǔ)陽還五湯靶標(biāo)信息的檢索。經(jīng)藥典和文獻(xiàn)查找TCMSP中未找到對應(yīng)靶標(biāo)的化合物，利用Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測。Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php)是一種獨特的生物信息學(xué)和化學(xué)信息資源相結(jié)合的藥物靶標(biāo)信息數(shù)據(jù)庫，反向整合靶點和化合物。上傳化學(xué)成分的sdf 格式至 Pharm Mapper 服務(wù)器平臺，選擇人類數(shù)據(jù)庫，設(shè)置最終返回300個靶點，獲得化合物預(yù)測靶點。通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索藥物對應(yīng)的靶標(biāo)，實現(xiàn)對補(bǔ)陽還五湯靶標(biāo)信息，包括Uniprot 蛋白數(shù)據(jù)庫身份標(biāo)識號(UniProt ID)，基因名稱(Gene Name) 的確認(rèn)，從而進(jìn)行相關(guān)信息的進(jìn)一步預(yù)測分析。

1.3 動脈粥樣硬化靶標(biāo)預(yù)測利用人類表型本體數(shù)據(jù)庫 (HPO，https://hpo.jax.org/app/)檢索AS相關(guān)靶標(biāo)信息，包括Uniprot 蛋白數(shù)據(jù)庫身份標(biāo)識號(UniProt ID)，基因名稱(Gene Name)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析上傳補(bǔ)陽還五湯與AS相關(guān)靶點至 STRING(https://string-db.org/)，篩選大于0.9的最高置信度的靶點信息。通過Cytoscape 3.6.1構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯靶點與AS基因靶點之間的互作網(wǎng)絡(luò)。以“節(jié)點連接度(degree)”、“節(jié)點緊密度 (closeness) ”和“節(jié)點介度(betweenness) ”的中位數(shù)為卡值，選取同時符合 3個卡值的節(jié)點作為補(bǔ)陽還五湯防治AS網(wǎng)絡(luò)的核心靶點。并使用插件MCODE對核心靶點互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，以degree cutoff=2，node score utoff=0.2，K-score=5，max deapth=100為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 挖掘基因功能以及相關(guān)通路整合上述相關(guān)數(shù)據(jù)庫得到靶標(biāo)基因，運用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫6.8(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)在線工具，針對補(bǔ)陽還五湯治療AS的核心靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路以及GO生物過程、細(xì)胞組成、和分子功能富集分析。以FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到補(bǔ)陽還五湯治療AS的關(guān)鍵作用信號通路,并構(gòu)建“補(bǔ)陽還五湯-中藥-化學(xué)成分-核心靶點-關(guān)鍵通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯中所含藥物的成分組成基本信息及藥物間共有靶標(biāo)分析利用 TCMSP，以及通過相關(guān)文獻(xiàn)搜索，得到補(bǔ)陽還五湯所含中藥基本信息(Tab 1) 。

Tab 1 Information of ingredients in Buyang Huanwu decoction and their putative targets

通過TCMSP以及相關(guān)文獻(xiàn)搜索，得到補(bǔ)陽還五湯中各單味藥化學(xué)成分共計140 個，預(yù)測靶標(biāo)174個，并對其中的共有靶標(biāo)進(jìn)行分析(Tab 2) 。其中黃芪與赤芍、黃芪與紅花的共有靶標(biāo)分別為 93、97個，紅花與赤芍、紅花與川芎的共有靶標(biāo)分別為99、95個，協(xié)作關(guān)系最密切，可能是治療AS的重要藥對。

Tab 2 Common targets between every two herbs in Buyang Huanwu decoction

2.2 補(bǔ)陽還五湯化學(xué)成分靶標(biāo)預(yù)測與分析通過 Cytoscape 3.6.1挖掘補(bǔ)陽還五湯 7種藥物靶標(biāo)與AS基因靶標(biāo)之間的相互作用。根據(jù) degree 值(Tab 3) 僅顯示前10個靶點，推測補(bǔ)陽還五湯可能是通過調(diào)節(jié)MAPK1、PIK3R1、SRC、AKT1、APP、HRAS、JUN、TP53、EGF、RELA等關(guān)鍵基因來調(diào)節(jié)AS的發(fā)生與發(fā)展。

2.3 核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)通過Cytoscape 3.6.1對補(bǔ)陽還五湯調(diào)節(jié)AS的候選靶點建立互作網(wǎng)絡(luò)，如Fig 1所示。根據(jù) degree 值僅顯示前 100 個靶點，圖中節(jié)點的大小與degree值成正比關(guān)系。

Tab 3 Interaction between Buyang Huanwu decoction targets and atherosclerosis gene target

Fig 1 Core node interactional network between putative drug targets of Buyang Huanwu decoction and atherosclerosis targets

2.4 補(bǔ)陽還五湯防治AS關(guān)鍵靶標(biāo)GO 和 KEGG 通路富集分析通過GO富集分析后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯的藥物化學(xué)成分對應(yīng)關(guān)鍵靶點參與了凋亡過程的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄、肽基絲氨酸磷酸化、肽基酪氨酸自磷酸化、膽固醇穩(wěn)態(tài)、血管生成、對毒品的反應(yīng)、細(xì)胞增殖調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控等生物過程和基因功能，對AS進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中FDR值較小的 20位，見Fig 2。

應(yīng)用插件MCODE進(jìn)行基因的聚類分析后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯的藥物化學(xué)成分對應(yīng)關(guān)鍵靶點參與脂質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡等生物過程，對AS進(jìn)行調(diào)節(jié)。對score>5的基因簇進(jìn)行打分并排序，關(guān)鍵的靶點聚成3類,如Fig 3所示。

利用DAVID 6.8對各基因簇進(jìn)行注釋，篩選FDR<0.05的GO條目，其中基因簇1中相關(guān)基因主要參與脂質(zhì)代謝相關(guān)的細(xì)胞組成與生物功能，基因簇3中相關(guān)基因與細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)，而基因簇2中生物過程不滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見Tab 4。

Fig 3 Interaction module of modified Buyang Huanwu decoction combined with epimedium-AS-gene based on MCODE

Tab 4 Clustering analysis results of Buyang Huanwu decoction Network Nodes

KEGG 富集分析結(jié)果顯示核心靶點與癌癥、乙型肝炎、癌癥中的蛋白聚糖通路以及炎癥、免疫相關(guān)的T 細(xì)胞受體信號通路、PI3K-Akt 通路和FoxO信號通路密切相關(guān)。其中 FDR值較小的20位見Fig 4。

3 討論

3.1 補(bǔ)陽還五湯藥物成分分析補(bǔ)陽還五湯具有多成分、多靶點、調(diào)節(jié)方式多樣的特點，在多味藥作用疊加的基礎(chǔ)上，補(bǔ)陽還五湯還會產(chǎn)生復(fù)雜的協(xié)同效應(yīng)。黃芪、川芎、赤芍、紅花等均為臨床治療AS使用頻率較高的中藥。紅花與黃芪，紅花與赤芍相互關(guān)聯(lián)的成分最多。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，芍藥中的芍藥苷通過上調(diào)SIRT1增強(qiáng)自噬而減弱了ox-LDL誘導(dǎo)的凋亡和粘附分子表達(dá)[7]；黃芪和紅花中的槲皮素可以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成并延緩衰老[8]；山奈酚通過抑制TLR4 /NF-κB信號通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9]?？梢酝茰y在防治AS方面紅花和黃芪，紅花和赤芍配伍可能具有一定的協(xié)同作用。

Fig 4 KEGG terms of candidate targets of Buyang Huanwu decoction against atherosclerosis

3.2 基因功能與相關(guān)通路分析KEGG通路分析表明癌癥，乙型肝炎以及眾多免疫和炎癥通路可能是網(wǎng)絡(luò)中重要的信號通路。癌癥的研究是近些年來研究的熱點，炎癥、細(xì)胞增殖失調(diào)、氧化應(yīng)激等條件易于發(fā)生AS，且利于不同類型的癌癥的形成，用于治療AS的他汀類藥物差異性的調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子可以用于癌癥治療[10]。核心靶點TP53、SRC、HRAS等腫瘤相關(guān)基因與乳腺癌、甲狀腺癌、直腸癌密切相關(guān)[11]，這提示補(bǔ)陽還五湯的應(yīng)用可能對癌癥的防治具有重要意義。對LDL具有反應(yīng)性的T細(xì)胞可以引發(fā)體液免疫反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞受體信號通路可以降低血漿膽固醇和減少病變形成的抗動脈粥樣硬化免疫反應(yīng)[12]。

補(bǔ)陽還五湯的網(wǎng)絡(luò)藥理分析了7種草藥，140種化合物和690種靶基因，并預(yù)測了174個核心靶基因和AS有關(guān)的主要通路和生物過程。MAPK1、PIK3R1、SRC、AKT1、APP、HRAS、JUN、TP53、EGF、RELA是網(wǎng)絡(luò)中的主要靶基因。通過對補(bǔ)陽還五湯靶點互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析得出了3個顯著性較強(qiáng)的基因簇。其中基因簇2中的生物過程FDR值>0.05，顯著性最強(qiáng)的基因簇1包含了APP、VEGFA、APOA2、APOA1、APOB、APOE、APOA5、MAPK1等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的39個基因。在AS患者中，脂質(zhì)代謝與多種生物過程和細(xì)胞組成相關(guān)，如膽固醇穩(wěn)態(tài)，膽固醇外排，以及細(xì)胞外空間、乳糜微粒、超低密度脂蛋白顆粒等。APOA2、APOB、APOA1、APOE、APOA5是載脂蛋白家族重要成員，調(diào)控膽固醇的轉(zhuǎn)運。當(dāng)巨噬細(xì)胞在與低密度脂蛋白孵育期間積累大量膽固醇時，巨噬細(xì)胞不僅會在脂質(zhì)小滴中儲存過多的膽固醇，還會將過量的未酯化膽固醇沉積到巨噬細(xì)胞周圍和下面的細(xì)胞外基質(zhì)中[13]。MAPK1即ERK2，實驗研究表明下調(diào)ERK1 / 2過表達(dá)可以抑制巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞的形成，并激活膽固醇逆向轉(zhuǎn)運[14]；NF-κB家族的重要成員RELA即p65，已有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可能與抑制TLR4炎癥通路包括NF-κB在內(nèi)的主要元件有關(guān)[15]。最近的研究發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境中，巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)MAP激酶ERK1/2，參與激活NF-κB亞基p65，并通過誘導(dǎo)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1和載脂蛋白A1基因促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運[16]。因此，我們推測補(bǔ)陽還五湯可以通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝促進(jìn)AS的治愈?；虼?中基因參與對細(xì)胞凋亡的調(diào)控，細(xì)胞凋亡是對死亡信號的響應(yīng)。研究表明補(bǔ)陽還五湯可能通過CDK5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，下調(diào)caspase-3，Bax / Bcl-2抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[17]。調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡是補(bǔ)陽還五湯防治AS的重要途徑，TP53(p53)是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與外在的凋亡途徑，或通過內(nèi)在的線粒體途徑調(diào)控凋亡小體的形成，進(jìn)而促進(jìn)胱天蛋白酶介導(dǎo)的凋亡[18]，補(bǔ)陽還五湯可能參與調(diào)控p53抗AS。

Fig 5 Multi-level network of Buyang Huanwu decoction, Chinese herbs, ingredients, critical targets and pathways

從多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(Fig 5)可以看出補(bǔ)陽還五湯多成分、多靶點、整體協(xié)同的抗AS作用。網(wǎng)絡(luò)藥理分析對進(jìn)一步闡明其防治AS的物質(zhì)基礎(chǔ)，深入挖掘和開發(fā)經(jīng)典名方補(bǔ)陽還五湯有重要意義。但本研究也存在一些缺陷，在利用TCMSP時無法考慮到方藥組成用量、煎煮方藥時可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)、藥物體內(nèi)代謝過程、而且不能預(yù)測尚未發(fā)現(xiàn)的抗AS機(jī)制、以及平臺數(shù)據(jù)庫的條件局限性問題。