槲皮素對大鼠皮層神經元的雌激素樣作用研究

甄艷杰，劉靚靚，趙雨薇，鐘 明，沈麗霞

(河北北方學院藥學系，河北省神經藥理學重點實驗室，河北 張家口 075000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)屬于一種典型的中樞神經系統退行性疾病，臨床表現為進行性的記憶的減退以及認知功能的損害[1]。目前認為AD有兩個比較明顯的病理學特征：由β-淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques)在大腦皮層和海馬神經元細胞外大量出現；由神經元細胞內高度磷酸化的tau蛋白所導致的神經纖維纏結(neurofibrillary tangles)。而研究發現AD最終都表現著相同的病理改變，即大腦皮層、海馬、額顳葉中的神經元突觸大量缺失和神經元的細胞凋亡，這些神經元突觸和神經細胞與認知功能密切相關[1]。由于其發病機制尚不清楚，目前臨床治療藥物只能短期改善癥狀，而不能阻止或延緩疾病的進展，因此尋找能夠治療AD的有效藥物是當前亟待解決的難點。

雌激素對大腦中神經元有明確的保護作用，可對抗Aβ誘導的神經退行性病變[2-4]，雌二醇可通過上調Bcl-2 mRNA的表達以及下調Bax mRNA的表達從而減少Aβ25-35對PC12細胞的神經毒性[5]。女性進入絕經期后，體內雌激素水平明顯下降，長期以來臨床采用人工合成的雌激素替代治療(estrogen replacement treatment，ERT)，使患阿爾茨海默病危險下降50%。然而ERT所帶來的如生殖系統腫瘤及乳腺癌的發生等不良反應影響其推廣應用。人們致力于尋求雌激素的替代物，期望這種替代物能保留雌激素的保護作用，同時避免上述的不良影響，來源于植物而且結構類似雌激素的植物雌激素(phytoestrogen)正是其中的重要一類，有望成為預防和治療AD的雌激素替代物。如金雀異黃素(genistein，Gen)可通過與胞膜胞內的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結合從而發揮神經保護作用，可以明顯提高Aβ31-35損傷后的皮層神經元活性，并減少彗星細胞的數量及其拖尾長度[6]。

槲皮素(quercetin，Que)屬天然黃酮類物質，與雌激素有著相似的化學結構，具有雌激素樣作用。目前已有研究發現，槲皮素可以減少SH-SY5Y細胞中淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein)的成熟，可以減少AD模型大鼠中Aβ所占的比例。課題組前期研究表明，槲皮素可通過經典的ER途徑，影響PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路的激活，并且對Aβ25-35誘導的PC12細胞的損傷具有類雌激素樣神經保護作用[7]。本研究將從槲皮素對大鼠皮層神經元細胞的保護作用入手，對槲皮素介導雌激素受體途徑影響大皮層神經元進行研究。同時利用ER完全拮抗劑，進一步探索槲皮素發揮神經保護作用的相關途徑，并為神經系統疾病藥物的開發提供新的思路和策略，從而探索植物雌激素能夠替代雌激素作為未來參與治療AD藥物的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 Sprague Dawley(SD)大鼠,許可證號：SYXK(京)2014-0037，新生24 h內的SD大鼠(乳鼠)

1.1.2藥物與試劑 槲皮素(中國藥品生物制品檢定研究所，批號：100081-200907)、金雀異黃素(中國藥品生物制品檢定研究所，批號：111704-201302)、17β-雌二醇(abcam 公司，批號：APN11282-1-1)、ER完全拮抗劑(ICI182,780，abcam 公司，批號：APN07104-1-1)、Neurobasal-A Medium培養基(Gibco 公司，批號：1645623)、B-27 Supplement(50×)(Gibco 公司，批號：1674937)、DMEM/高糖培養基(HyClone 公司，批號：SH30284.01)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：20150715)、MTT(Sigma 公司，批號：MKBS4732V)、Neuronal ClassⅢ β-Tubulin (Tuj1)抗體(碧云天生物技術公司)、CyTM3-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(Jackson Immuno Research 公司，批號：101887)、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗IGG(H+L)(Novus Biologicals 公司，批號：4103945)、β-actin(Santa Cruz 公司，批號：C2014)、ERβ抗體(Novus Biologicals 公司，批號：2100-1P140905)、ERα抗體(Novus Biologicals 公司，批號：2100-1P140905)

1.1.3儀器 CO2培養箱(Thermo 公司)，超速冷凍離心機(Sigma公司)，熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)，體視學顯微鏡(Leica公司)，多功能酶標儀(Tecan公司)，化學發光凝膠成像系統(ProteinSimple公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠皮層神經元的原代培養 在低溫條件下取乳鼠的大腦皮層組織，小心剝去腦膜及血管，剪碎成小塊，大小為1 mm3左右，加入0.125%的胰蛋白酶，加入離心管中，在37 ℃水浴10 min。用含10%胎牛血清的高糖培養基終止消化，離心除去上清，重復上述操作兩次。加入培養基吹散，通過200目篩，預先用多聚賴氨酸包被培養板，而后將細胞懸液移入包被完成的培養板中，并在37 ℃，5% CO2培養箱中孵育培養，6 h后，將培養基改為Neuronbasal +B27的神經元專用無血清無酚紅培養基，繼續在此培養基中培養。培養6 d后，通過免疫熒光染色法鑒定神經元純度。將培養至6 d的細胞用Tuj1抗體和DAPI進行標記，倒置顯微鏡下觀察，鏡下可見所有細胞核均發出藍色熒光，而Tuj1陽性細胞則顯示紅色熒光，將兩圖進行重疊可計算出神經元細胞所占的比例，將計算出的比例用作神經元細胞的純度。

1.2.2MTT檢測槲皮素對神經元細胞活性的影響 以合適的細胞密度在包被后的96孔板中接種皮層神經元細胞，培養6 d后，按如下分組加入不同的含藥培養基繼續培養24 h，DMSO空白對照組(體積含量比不超過0.1%)、17β-E2陽性藥對照組(0.02 μmol·L-1)、Gen陽性藥對照組(25 μmol·L-1)、Que低劑量組(50 μmol·L-1)、Que中劑量組(100 μmol·L-1)、Que高劑量組(200 μmol·L-1)，每組設置6個復孔。同時完全拮抗ER的皮層神經元細胞模型，以檢測槲皮素對完全拮抗ER的皮層神經元細胞活性的影響，在藥物干預前每孔加入ER完全拮抗劑ICI182,780(每孔中的ICI182,780終濃度為1 μmol·L-1)，置于37 ℃，5% CO2培養箱中孵育2 h。孵育完成后棄去板中含拮抗劑的培養基，并按依次加入上述含藥培養基，每組設置6個復孔，每孔加入100 μL含藥培養基，繼續培養24 h和48 h。采用MTT法測定OD值并計算細胞存活率(實驗組OD值/DMSO空白對照組OD值×100%，survival rate，SR)。

1.2.3免疫熒光檢測槲皮素對神經元細胞形態的影響 在包被后的24孔板將皮層神經元接種后培養6 d，按照以下不同的分組添加不同的含藥培養基繼續培養24 h，DMSO空白對照組(體積含量比不超過0.1%)、17β-E2陽性藥對照組(0.02 μmol·L-1)、Gen陽性藥對照組(25 μmol·L-1)、Que低劑量組(50 μmol·L-1)、Que中劑量組(100 μmol·L-1)、Que高劑量組(200 μmol·L-1)。培養24h后棄去培養基，加入新鮮配制的4% 多聚甲醛在室溫下固定30 min，用體積分數為0.2%的TritonX-100在室溫下進行透化處理20 min，使用5%的牛血清白蛋白封閉30 min，將稀釋后的Tuj1抗體加入孔板中，并在4 ℃下孵育過夜，再加入熒光二抗(CyTM3-conjugated affinipure goat anti-mouse IgG，1 ∶800 PBS稀釋)，于暗盒中在室溫條件下孵育1 h。去除移去熒光二抗，滴加完成稀釋的DAPI染色工作液(1 ∶80 PBS稀釋)，于暗盒避光對細胞核進行復染15 min。在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并拍照采集圖像，采集的圖像使用Image-Pro Plus軟件進行分析處理。

1.2.4Western blot檢測槲皮素對神經元細胞ER蛋白表達的影響 將皮層神經元細胞接種在包被后的6孔板中培養6 d。根據“1.2.2”中的實驗組，添加不同含藥培養基，培養24 h。收集培養后的細胞，添加細胞裂解液，置于冰上，裂解30 min，用移液槍不斷吹打以確保細胞充分裂解，4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min。用BCA法測定蛋白含量，裂解液調整蛋白濃度，使各不同分組的蛋白濃度一致，按4 ∶1的比例混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液，在95 ℃金屬浴中10 min，以確保蛋白充分變性。確保每孔蛋白上樣量20-25 μg，使用10% SDS-PAGE凝膠進行蛋白分離，轉膜，5 %脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗β-action(1 ∶500)、雌激素受體α/β一抗(1 ∶300)，4℃孵育過夜。第二天將膜用TBST洗3次，每次洗10 min。室溫孵育二抗(Goat anti-mouse IgG/HRP，1 ∶4 000)2 h。用TBST將膜清洗3次，每次清洗10 min，發光，拍照，成像，分析條帶灰度。

2 結果

2.1 原代培養皮層神經元細胞純度神經元培養5 d后，神經細胞生長較好，細胞突觸進一步伸長和增粗，具有雙極、多極突起，并交織成網絡；在培養7 d后，細胞體較大，周圍可見明顯光暈，細胞突觸延長、增粗且分支較多，突觸間、突觸與胞體之間聯系增多，形成密集的神經網絡；培養9 d后，神經元細胞開始退化，大量細胞體團聚成簇，且折光性降低，突觸減少、縮短，以及胞質內空泡或顆粒增多；結果顯示培養5-8 d的細胞處于最佳狀態，可將其用于后續試驗。用Tuj1抗體和DAPI進行標記后，隨機選取6個視野中Tuj1陽性神經元細胞的數目占總細胞的比例，顯示培養的細胞中神經元純度在95%左右。

2.2 槲皮素對大鼠皮層神經元細胞活性的影響與溶劑對照組相比，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)處理細胞24 h、48 h時可以提高大鼠皮層神經元細胞的活性，且差異有統計學意義(P<0.05)；而與17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)相似，Que濃度為50 μmol·L-1、100 μmol·L-1時，在處理24 h、48 h后也可以明顯提高皮層神經元的活性，差異有顯著性(P<0.01)，而Que(200 μmol·L-1)組僅在藥物干預24 h時才可提高皮層神經元的細胞活性，并且差異有統計學意義(P<0.05)(Tab 1)。不同濃度的Que對大鼠皮層神經元的活性有不同的影響，通過組間兩兩比較發現Que(50、100 μmol·L-1)處理組的大鼠皮層神經元的細胞活性均高于Que(200 μmol·L-1)處理組(P<0.05)，而Que(50 μmol·L-1)和Que(100 μmol·L-1)兩組之間僅在藥物進行干預48 h時才會顯示出差異具有統計學意義(P<0.05)(Tab 1)。使用ICI182,780拮抗劑孵育后，再使用藥物干預，發現孵育組與未孵育組比較，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1)，神經元活性存在明顯差異(P<0.05)(Tab 2、3)，皮層神經元細胞活性的影響均可被ICI182,780完全拮抗。但是溶劑對照組與使用拮抗劑的對照組相比差異無顯著性(Tab 2、3)。

Tab 1 Effect of Que on activity of cortical neurons n=6 )

Tab 2 Effect of Que treatment for 24 h on activity of antagonist estrogen receptor in cortical neurons (positive control group: 17β-estradiol) n=6)

Tab 3 Effect of Que treatment for 24 h on activity of antagonist estrogen receptor in cortical neurons (positive control group: genistein) n=6)

2.3 槲皮素對大鼠皮層神經元細胞形態的影響與對照組相比，用17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1)處理過的大鼠皮層神經元細胞的突觸數目明顯增多(P<0.05)(Fig 1)，從圖片上可看出，和對照組相比，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1)組中神經元細胞的生長狀態較好，細胞突觸明顯增粗且分支較多，并且突觸間、突觸與胞體之間聯系更加緊密；當分別與ICI182,780共同孵育時，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1)對皮層神經元突觸的促生長作用減弱，突觸數量明顯減少(P<0.05)(Fig 2)，突觸明顯變細，并且突觸間的連接變少。

Fig 1 Neurite outgrowth of cortical neurons treated with E2 (0.02 μmol·L-1), Gen (25 μmol·L-1) and Que (50 μmol·L-1, 100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 24 h

Fig 2 Neurite outgrowth of cortical neurons treated with E2 (0.02 μmol·L-1), Gen (25 μmol·L-1) and Que (50 μmol·L-1, 100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 24 h with or without pre-incubated with ICI182,780 for 2 h

2.4 槲皮素對大鼠皮層神經元ER表達量的影響β-actin作為內參蛋白，與對照組相比，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50 μmol·L-1、100 μmol·L-1)處理組均能上調大鼠皮層神經元細胞ERα蛋白水平(P<0.05)，而對ERβ蛋白表達的影響并不明顯(Fig 3)。當用ICI182,780孵育后，與未孵育組比較，17β-E2(0.02 μmol·L-1)、Gen(25 μmol·L-1)、Que(50、100 μmol·L-1)ERα蛋白表達表達被拮抗，未見明顯上調(Fig 4)。

3 討論

隨著我國人口老齡化，罹患AD的老年患者日漸增多，AD的主要病理癥是多種原因導致的神經元的損傷，因此對于神經元細胞的保護就顯得非常重要。新生SD大鼠皮層神經元細胞的原代培養已被作為神經系統疾病的細胞模型[8]，為探索神經系統疾病的發病機理及藥物篩選提供了良好的平臺。大鼠皮層神經元細胞在培養至d5-8時生長狀態最佳；培養皮層神經元細胞時使用不含酚紅的培養基，即培養基中不存在酚紅等具有雌激素樣作用的物質，因此，可以確保培養5-8 d的皮質神經元細胞可以保存在雌激素耗竭狀態；Tuj1是一種微管蛋白，廣泛存在于細胞骨架中，其主要的功能是參與神經元細胞類型特異性的分化，Tuj1抗體廣泛用于鑒定神經元細胞的標記物[9]。原代培養的皮層神經元的特異性及純度通過免疫熒光實驗進行檢測，其純度高達95%。

Fig 3 Protein abundances of ERα and ERβ in cortical neurons treated with E2(0.02 μmol·L-1), Gen(25 μmol·L-1) and Que (50 μmol·L-1, 100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 24 h n=3)

Fig 4 Protein abundances of ERα in cortical neurons treated with E2 (0.02 μmol·L-1), Gen (25 μmol·L-1) and Que (50 μmol·L-1, 100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 24 h with or without pre-incubated with

槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，其化學結構和雌激素極其相似，是植物雌激素的一種，可從多種食物和植物中提取，而無明顯毒性和不良反應。近年來研究顯示槲皮素作為一種植物雌激素同樣具有神經元保護作用，可明顯改善神經退行性病變動物的記憶和行為能力[10-11]。MTT實驗結果顯示槲皮素在一定的劑量范圍內可以提高大鼠皮層神經元細胞的活性，初步驗證了槲皮素的神經元保護作用。通過觀察皮層神經元突觸的數目，結果顯示槲皮素可以明顯促進皮層神經元生長，增加皮層神經元的突觸密度，并可見不同形態的突觸結構，這與17β-E2, Gen的神經元保護作用作用相類似。目前研究發現植物雌激素主要通過與ERs結合發揮雌激素樣作用[12]。ICI182,780作為實驗用ER完全拮抗劑，可以完全阻斷雌激素等具有雌激素樣作用的物質通過ER介導的生物學活性，在MTT實驗中，當使用ICI182,780孵育后，槲皮素對大鼠皮層神經元的保護作用明顯被抑制，同時也可抑制17β-E2，金雀異黃素的神經元保護作用。Western blot結果顯示槲皮素可以明顯提高ERα的蛋白表達，而對于ERβ，槲皮素和對照組的蛋白表達量之間差異無顯著性；而在使用ICI182,780孵育后ERα蛋白的表達量明顯少于未孵育組。表明槲皮素具有一定的雌激素樣作用，且對皮層神經元的保護作用可能主要是由ERα介導的。