基于iTRAQ標記聯合IPA生物信息分析探究大黃素鎮痛作用的機制

陳 鵬，王 琛，張 杰，吳智兵，吳遠華

(1.貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；3.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

神經病理性疼痛是指軀體感覺系統損傷或疾病所引發的疼痛[1]。最新全球范圍內流行病學調查研究顯示，神經病理性疼痛在普通人群中的患病率高達10%，其可出現在不同性質的臨床疾病中，包括糖尿病、腦卒中、帶狀皰疹、多發性硬化、感染、癌癥、腰或頸神經根型神經病變、手術及創傷等[2,3]。神經病理性疼痛的臨床表現主要包括自發性疼痛、痛覺過敏及異常性疼痛，且常伴有較為顯著的睡眠障礙、抑郁和焦慮等心理障礙，嚴重影響著患者的日常生活及行為功能，也給社會造成巨大的經濟和醫療負擔[4]。目前，神經病理性疼痛的治療主要以抗癲癇、抗焦慮及阿片類藥物為主，但藥效有限，副作用明顯。因此，深入探討疼痛的發病機制，尋找并開發新的鎮痛藥物已成為慢性疼痛研究的重要課題。

大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌)是天然蒽醌類衍生物，分子式C15H10O5，為中藥大黃的主要活性成分。前期本課題組研究發現大黃素能夠顯著改善慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)模型實驗大鼠自發性疼痛，提高痛覺閾值，緩解痛覺過敏，以50 mg·kg-1效果最佳。然而，關于大黃素具體鎮痛機制和作用靶點尚不清楚，有待于進一步深入研究。

本研究采用蛋白質組學同位素相對和絕對定量標記技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation， iTRAQ)對大黃素干預下不同處理組實驗大鼠脊髓組織差異表達蛋白進行鑒定和篩選，并結合創新途徑分析(ingenuity pathway analyses，IPA)對篩選差異表達蛋白進行經典通路分析、轉錄調控分析、疾病與功能分析及相互作用網絡分析等，從而明確大黃素鎮痛作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物30只SD大鼠，♂，7周齡，體質量(200±20)g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心[許可證編號：SCXK(粵)2013-0034]，飼養于SPF級動物實驗室。本實驗所有操作程序符合廣州中醫藥大學附屬醫院動物使用與倫理委員會審查。

1.2 藥物大黃素：購于成都曼思特生物科技有限公司，純度99.48%，規格1 g/瓶，批號MUST-16110712。

1.3 主要儀器Strata X C18脫鹽柱(美國Phenomenex公司)；E2695/2998高效液相色譜及XBridge Peptide BEH C18色譜柱(美國Waters公司)；Acclaim PepMap?100 C18上樣柱，Acclaim PepMap?RSLC C18分析柱，NanoLC 1 000 納升級高效液相及LTQ Orbitrap Elite 組合式質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 動物分組與給藥將30只大鼠按照隨機數字表分為假手術組(Sham, S)、模型組(Model, M)及大黃素組(Emodin, E)。術后1 d開始大黃素組給予大黃素混懸液，每日一次，連續15 d。

2.2 CCI模型制備麻醉，俯臥位固定，暴露坐骨神經，4-0絲線做4道結扎，間隔1～2 mm，壓迫程度以神經微塌陷為宜。假手術組僅暴露神經但不結扎。

2.3 藥物制備大黃素溶液制備：將0.312 5 g大黃素溶解于50 mL 0.05% CMC-Na中制備成濃度為6.25 g·L-1大黃素混懸液。

2.4 樣品制備給藥后15 d，將大鼠深度麻醉，取術側脊髓組織，置于-80 ℃超低溫冰箱內備用。

2.5 蛋白提取及濃度測定取脊髓組織樣品，加入適量細胞裂解液(8 mol·L-1尿素、2 mmol·L-1EDTA、10 mmol·L-1DTT、1%蛋白酶抑制劑混合液)，冰浴超聲破胞3次；4 ℃離心10 min后取上清液，加入預冷的TCA，-20 ℃沉淀2 h，4 ℃離心5 min，棄上清后，沉淀加入-20 ℃預冷的丙酮，洗滌3次去TCA，4 ℃離心5 min棄丙酮；加入復溶緩沖液(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1，pH 8.0)。參照試劑盒采用Bradford 法進行蛋白濃度測定。

2.6 iTRAQ標記分別取50 μg樣品調整等體積，加入10 mmol·L-1DTT 37 ℃孵育60 min，再加入55 mmol·L-1IAM室溫孵育60 min；稀釋后按質量比1 ∶50加入胰蛋白酶，37 ℃孵育過夜，再按質量比1 ∶100加入胰蛋白酶37 ℃孵育4 h。Strata XC18脫鹽柱除鹽。運用iTRAQ標記試劑盒對各組樣品進行標記，標記信息為：假手術組-116、模型組-117及大黃素組-118。

2.7 肽段組分分離采用高pH C18色譜柱經HPLC色譜儀分離樣品，流動相A液為2%乙腈(pH 10),流動相B液為98%乙腈(pH 10)。88 min線性梯度洗脫樣品，液相流速為0.7 mL·min-1,洗脫期間檢測波長214 nm。共收集出的肽段流出組分，真空抽干后合并成12組分進行質譜鑒定。

2.8 肽段質譜鑒定將12個組分溶于20 μL NanoLC A液，進樣2 mL，經Acclaim PepMap?100 C18上樣注后使用Acclaim PepMap?RSLC C18分析注梯度洗脫，流動相A液為2%乙腈和0.1%甲酸，流動相B液為98%乙腈和0.1%甲酸，液相流速為300 nL·min-1，時間為90 min。洗脫液進入Orbitrap Elite質譜儀進行鑒定。質譜參數具體設置為：一級質譜分辨率為70 000，掃描范圍為350～1 500 m/z；二級質譜分辨率為17 500，碰撞歸一化能量為30，采集標準為20個峰強度最高。

2.9 IPA分析使用Proteome Discoverer 1.3軟件將肽段鑒定的原始圖譜文件轉換為.mgf文件，通過MASCOT 2.3.0服務器進行數據檢索，以FDR<0.01標準，組間差異倍數≥±1.2且P<0.05的蛋白篩選為差異表達蛋白。將篩選的差異表達蛋白上傳至IPA生物信息分析平臺，進行經典通路分析、轉錄調控分析、疾病與功能分析及相互作用網絡分析。

3 結果

3.1 大黃素對CCI大鼠脊髓組織蛋白表達的影響運用蛋白質組學技術共鑒定出不同處理組脊髓中差異表達蛋白177個，其中MvsS 篩選出表達蛋白102個，上調52個，下調50個；EvsM 篩選出差異表達蛋白109個，上調66個，下調43個，結果見Fig 1。

3.2 差異表達蛋白經典通路分析Fig 2為假手術組、模型組及大黃素組脊髓組織差異表達蛋白在不同經典通路中表達趨勢熱圖，結果顯示 EvsM 與 SvsM鑒定出的差異蛋白在不同經典通路中趨勢基本一致，說明大黃素能夠反向調節CCI模型中異常激活或抑制的通路。為進一步研究大黃素鎮痛作用所涉及的信號通路，我們對篩選的差異表達蛋白進行經典通路分析。Fig 3顯示了 EvsM 差異表達蛋白所涉及的Top20經典通路，其中預測激活的通路包括肝X受體/維甲酸X受體(liver X receptor/ retinoid X receptor，LXR/RXR)激活及巨噬細胞中一氧化氮和活性氧產生；預測顯著抑制的通路包括脊髓背角神經元神經病理性疼痛信號通路、促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GNRH)信號、突觸長時程增強、神經元環腺苷酸反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein， CREB)、突觸發生信號通路、阿片信號通路及鈣離子信號(z-score>2)。

Fig 1 Volcano plot of differently-expressed proteins in spinal cord

Fig 2 Heat map of classical pathways mediated by differently-expressed proteins

Fig 3 Top20 classical pathways mediated by differently-expressed proteins

Fig 4為詳細信號調控通路圖，進一步深入分析各經典通路上差異蛋白的表達趨勢及分子功能。其中以脊髓背角神經元神經病理性疼痛信號為例，與模型組相比，大黃素組實驗大鼠脊髓組織中原肌球蛋白相關激酶B(tropomyosin-related kinase B，TrkB)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、鈣調蛋白激酶Ⅱ(Ca/calmodulin-dependent protein kinases，CaMKⅡ)及蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)表達均下調，主要介導突觸后膜N-甲基-D天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)及α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR)等相關受體磷酸化及細胞核內CREB信號通路激活。

3.3 差異表達蛋白上游調控因子上游調控因子分析主要預測差異表達蛋白的上游調控因子。如Tab 1所示，經分析共預測出8個上游調控因子，包括TCF7L2、MLXIPL、APP、IFNG、TWIST1、Esrra、RICTOR及HMGA1。如Fig 5所示，上游調控因子與目標分子間存在四種作用關系，分別為一致激活、一致抑制、結果與下游分子狀態不一致及無預測效果。例如，APP被預測為強烈激活，該基因存在C3、ALB、SUCLG、S100B、RPS6及GFAP在內的6個一致激活的基因。RICTOR被預測為強烈抑制，該基因抑制導致下游基因PRKCB被抑制。

3.4 差異表達蛋白相互作用網絡根據不同疾病與功能，進一步深入分析 EvsM 差異表達蛋白間相互作用關系，并構建IPA蛋白互作網絡。如Tab 2所示，將Score >20分評定為可信，共構建出5個確信度較高的蛋白互作網絡，分別是心血管疾病、代謝性疾病、機體損傷和異常，癌癥、細胞死亡和存活、RNA損傷和修復，細胞間信號與相互作用、藥物代謝、神經系統發育和功能，細胞發育、細胞功能和維持、細胞生長和分化，碳水化合物代謝、細胞損傷、小分子生物化學。其中與神經病理性疼痛最為密切相關的是細胞間信號與相互作用、藥物代謝、神經系統發育和功能。如Fig 6所示，該網路中包含6個上調蛋白，14個下調蛋白，這些蛋白共同參與了Akt、CREB及Actin等相關分子調節，其中CaMKⅡ、PKA及PP2A等蛋白與其他蛋白聯系最為密切。

Fig 4 Neuropathic pain signaling in dorsal horn neurons

Tab 1 Upstream regulators of differently-expressed proteins in E vs M

Tab 2 Protein interaction network of differently-expressed proteins

Fig 5 Figure of upstream regulators

4 討論

神經病理性疼痛發病機制較為復雜，仍缺乏統一認識及廣泛有效的臨床藥物。中醫學認為，“不通則痛”是疼痛的主要發病機制，而氣滯血瘀是關鍵致病因素，行氣活血、以通治痛是急慢性疼痛治療的重要原則。大黃味苦，氣香而性涼，能入血分，破一切血瘀，具有活血化瘀的功效；同時可推陳致新，通暢氣機而安和五臟。故歷代醫家以大黃為主要藥物創立“升降散”、“大黃牡丹湯”、“下瘀湯”及“大黃附子湯”等名方，臨床上用于治療多種類型的急慢性疼痛。大黃素是中藥大黃的主要活性成分之一，本課題前期研究發現大黃素在神經病理性疼痛CCI動物模型中具有顯著的鎮痛作用。脊髓背角是疼痛信息處理和傳遞的初級整合中樞，脊髓中樞敏化在神經病理性疼痛發病過程中發揮關鍵作用。因此本研究旨在運用蛋白質組學技術篩選出不同處理組差異表達蛋白并結合IPA生物通路分析，揭示大黃素鎮痛作用的脊髓機制。

Fig 6 Protein interaction network of differently-expressed proteins

經IPA經典通路分析，大黃素可顯著抑制脊髓背角神經元神經病理性疼痛信號通路、PKA信號通路、突觸長時程增強通路、神經元CREB信號通路及鈣離子信號通路等，從而抑制脊髓中樞敏化及突觸異常傳遞，緩解神經病理性疼痛。進一步深入分析各經典通路上差異蛋白的表達趨勢及分子功能，我們推測大黃素可下調PKC、CaMKⅡ及PKA等相關蛋白激酶表達，影響NMDA受體、AMPA受體及CREB核轉錄因子磷酸化，降低興奮性突觸后電流，抑制疼痛相關基因的表達，進而發揮鎮痛作用。此外，經IPA分析發現，大黃素亦可介導LXR/RXR通路激活，抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路，從而降低IL-1β等在內的炎癥介質表達水平，發揮抗神經病理性疼痛作用[5-7]。

隨后，本研究進一步運用IPA上游轉錄調控分析預測大黃素干預下脊髓組織中差異表達蛋白上游調控因子，其中與大黃素鎮痛作用相關的潛在因子主要為TCF7L2及APP。TCF7L2又稱為T細胞轉錄因子4(T cell factor 4，TCF4)，是T細胞因子/淋巴細胞增強子結合因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor，TCF/LEF)家族成員，在Wnt信號通路中發揮關鍵作用[8]。最新研究表明，TCF7L2通過Wnt/β-catenin信號調控少突膠質細胞分化、成熟，促進髓鞘形成和再生[9-11]。本研究亦發現大黃素組脊髓組織中髓鞘堿性蛋白、髓鞘蛋白脂質蛋白及髓鞘相關少突膠質細胞堿性蛋白等髓鞘相關蛋白表達升高。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是神經系統廣泛分布的Ⅰ型跨膜蛋白，其由分泌酶剪切后產生的代謝產物可溶性淀粉樣前體蛋白α(soluble APP alpha，sAPPα)能夠抑制神經元興奮性，改善突觸傳遞，發揮神經保護作用[12]。研究表明，APP及其代謝產物能夠抑制實驗小鼠痛覺過敏和炎癥性疼痛[13]。

最后，我們進一步分析了EvsM 差異表達蛋白間相互作用關系，并構建了IPA蛋白互作網路，其中與大黃素鎮痛作用最為相關的是細胞間信號與相互作用、藥物代謝、神經系統發育和功能。在該網路中鑒定出Akt、CREB及粘著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)等關鍵基因。Akt又稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB),是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其激活后可進一步磷酸化下游靶蛋白如NF-κB, 從而調控多種細胞活動和生物功能，并參與神經病理性疼痛發生[14-15]。CREB作為調節轉錄的核因子，廣泛表達于神經元中，其可被PKA、CaMKⅡ等多種蛋白激酶激活，調節神經元興奮性和突觸可塑性[16]。FAK是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，其與整合素配體結合后磷酸化激活，參與神經系統發育及突觸可塑性[17]。研究表明，FAK可通過抑制細胞膜鈣ATP酶影響細胞內鈣離子穩態，介導傷害性反應[18]。

本研究運用蛋白質組學技術聯合IPA生物信息分析揭示了大黃素可能通過抑制脊髓背角神經元神經病理性疼痛、突觸長時程增強、神經元CREB、突觸發生信號及鈣離子信號等發揮鎮痛作用。同時預測發現TCF7L2及APP是大黃素干預下差異表達蛋白可能的上游調控分子。最后，我們發現大黃素通過干預CaMKⅡ、PKA及PP2A等差異蛋白表達，調節“細胞間信號與相互作用、藥物代謝、神經系統發育和功能”互作網路，發揮抗神經病理性疼痛作用。