青霉素V鉀相關物質的研究

2020-12-16 10:57:40宋海英張小雙張現華呂永健

廣州化工 2020年23期

宋海英，張小雙，張現華，呂永健

(河北華北制藥華恒藥業有限公司，河北石家莊 051500)

青霉素V鉀屬于β-內酰胺類抗生素，分子結構主要由β-內酰胺環和四氫噻唑環組成，其抗菌譜與青霉素G相似[1-2]，能夠破壞細菌細胞壁，具有殺菌作用，是治療革蘭陽性菌及部分陰性菌感染的首選藥物[3-4]。在青霉素V鉀的工業生產中，由于降解反應，會產生一系列的降解產物。在提取過程中，一些雜質如果有效控制與去除，就不會帶入青霉素V鉀成品中，從而提高產品質量和收率[5-8]。

本論文通過高效液相色譜法(HPLC)對青霉素V鉀的發酵液及提取過程中相關物質進行了跟蹤檢測[9-11]，摸清了各工序中相關雜質的含量分布情況，并且闡明了提取過程中相關物質的量與提取過程的關系，并追蹤了成品中主要任意其他雜質的來源以及該雜質的主要影響因素分析[12-15]，為生產中有效控制主要任意其他雜質的量，減少青霉素V鉀的降解損失，提高青霉素V鉀成品的質量提供了依據。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

青霉素V鉀(對照品)，本廠自制；苯氧乙酸(BR)，上海撫生實業有限公司；系統適用性試劑：EDQM CS；發酵液、提煉液，本廠102車間提供；磷酸二氫鉀(分析純)，天津市鼎盛鑫化工有限公司；氫氧化鈉(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；乙腈(色譜純)，天津市康科德科技有限公司；甲醇(色譜級)，美國天地；磷酸，分析純，天津永大化學試劑有限公司；水為自制純化水。

儀器：LC-15C高效液相色譜儀(HPLC)，島津；色譜柱：依利特2.7 μm，4.6 mm×150 mm；DC-1506W低溫恒溫槽，深圳市三利化學儀器；W201恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司；DW型電動攪拌器，上海鷹迪儀器設備有限公司；SHB-Ⅲ循環水真空泵，鞏義市科瑞儀器有限公司；CS101-2ABN電熱鼓風干燥箱，重慶永生實驗儀器廠；BT100-2J蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司。

1.2 研究對象

青霉素V(PCV)易發生一系列降解反應。這些反應包括水解、脫羧、胺的親核攻擊、聚合和碳水化合物青霉噻唑酯的形成等。已知的相關雜質有：發酵產物A(青霉素)，加入的前體物質B(苯氧乙酸)，降解產物C(6-氨基青霉烷酸)，青霉素V的氧化產物D(4-OH青霉素V)，青霉素V噻唑酸E(兩個異構體)以及青霉素V脫羧噻唑酸F(兩個異構體),結構圖詳見文獻[11]圖1。

1.3 青霉素V鉀溶液的制備

取青霉素酸晶160 g加入1000 mL三口瓶中，加入500 mL丁醇，打開攪拌，用蠕動泵滴加15%碳酸鉀溶液，調溶液至所需pH值。將不同終點pH的成鹽溶液倒入結晶裝置中，真空共沸結晶至終點水分達到1.0%以下，停止加熱。

1.4 檢測方法

采用歐洲藥典EP9.0液相色譜法檢測青霉素V鉀，詳見《歐洲藥典EP9.0》P3315-3316。

2 結果與討論

2.1 提煉各工序中相關雜質的檢測

根據提煉的工藝流程，用HPLC分析方法檢測各歩過程，考察提煉過程中青霉素V鉀相關物質的變化情況，先后對發酵液、乙酸丁酯的反相(RB)、酸晶、PCV鉀濃液、母液五個工序的物料進行分析測定，結果見表1。

表1 提煉過程中PCV及其相關物質含量表

發酵過程中會發生氧化、水解等副反應，發酵液中已知雜質以青霉素噻唑酸為主，其次是未反應的苯氧乙酸和氧化產物4-羥基青霉素V鉀；從濾液到RB，經過酸化、脫色、反萃，由于PCV比較耐酸，反萃的堿化過程是在有機相中進行，脫色BA濃度較低，因而沒有新的降解雜質產生，青霉素噻唑酸部分去除，苯氧乙酸和4-羥基青霉素V鉀沒有變化；從RB到酸晶，經過酸化處理，沒有新的雜質產生，苯氧乙酸和青霉素噻唑酸大量去除，4-羥基青霉素V鉀少量殘留；從酸晶到PCV鉀濃液，經過堿化處理，而且在很濃的狀態下，有新的任意其他雜質產生(稱為雜質1，如圖1所示)，苯氧乙酸略有減少，青霉素噻唑酸有所增加，4-羥基青霉素V鉀變化不明顯；成品中主要已知雜質為4-羥基青霉素V鉀，還有少量任意其他雜質(雜質1)；PCV共沸結晶后母液中主要雜質為雜質1，其次為青霉素噻唑酸，說明雜質1在青霉素V酸加堿成鹽過程中產生，在共沸結晶過程中增大。

圖1 PCV成鹽溶液HPLC譜圖

2.2 任意其他雜質的影響因素考察

針對青霉素V酸制備青霉素V鉀溶液過程中產生的任意其他雜質(雜質1)，對其產生的條件及影響因素進行了考察。

2.2.1 成鹽溶液pH值對雜質1的影響

相同實驗條件下，控制PVC成鹽溶液終點pH值分別為6.2，6.5，6.8，7.0，7.2，考察不同終點pH對成鹽溶液中雜質1的影響，結果如圖2所示。從圖2可以看出，成鹽溶液中雜質1隨終點pH值升高而明顯增大，說明該雜質對堿敏感，在堿性條件下青霉素V鉀降解嚴重。因此，為了有效控制該雜質的含量，青霉素V鉀溶液成鹽過程中pH控制在6.5～6.8為宜。

圖2 PVC成鹽溶液終點pH對溶液中雜質1的影響

2.2.2 成鹽溶液濃度對雜質1的影響

相同實驗條件下，將相同量的青霉素V酸晶加入不同體積丁醇中，終點pH為6.70，考察青霉素V鉀成鹽溶液濃度分別為150000 U/mL、200000 U/mL、250000 U/mL、300000 U/mL對料液中雜質1的影響，結果如圖3所示。從圖3可見，隨著青霉素V鉀成鹽溶液濃度的升高，溶液中雜質1含量明顯增大，主要是由于青霉素V鉀成鹽溶液濃度越高，料液降解速度越快，雜質1的生成量越大。由于成鹽溶液還需進行共沸結晶，濃度與含水量直接影響結晶時間，結合能耗方面綜合考慮青霉素V鉀成鹽溶液濃度控制在300000 U/mL以內為宜。

圖3 PVC成鹽溶液濃度對溶液中雜質1的影響

2.2.3 加堿時間對雜質1的影響

相同實驗條件下，控制不同的碳酸鉀滴加時間，檢測成鹽溶液中相關物質，考察不同加堿時間10 min、20 min、30 min、40 min、50 min對料液雜質1的影響，結果見圖4。從圖4可以看出，隨著加堿時間的延長任意雜質明顯減小，主要是由于加堿速度快會使青霉素V鉀溶液局部過堿，造成物料降解，雜質1大量生成。延長加堿時間可以有效避免局部過堿，從而有效控制雜質1的生成。青霉素V酸成鹽過程中適宜的加堿時間為40 min左右。