瑞舒伐他汀鈣片含量測定方法研究*

朱生良，許鳳清，蔣 磊

(1 合肥凱石醫藥科技有限公司，安徽 合肥 230061；2 安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012)

瑞舒伐他汀鈣(rosuvastatin calcium)，商品名為Crestor(美國)，可定(中國)和冠脂妥(中國香港)，是新一代的羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能顯著降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)[1]，具有強效降脂作用，臨床于治療高膽固醇血癥及混合型血脂異常相關性疾病[2-4]。瑞舒伐他汀鈣的相關物質及降解雜質復雜[5-6]，本文以4種常見雜質為參照，研究瑞舒伐他汀鈣片HPLC測定方法，確保臨床用藥的有效性及安全性。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters alliance e2695高效液相色譜儀，2998二極管陣列檢測器，waters empower 3網絡版色譜工作站，美國Waters公司；MS-105DU電子天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 試 藥

瑞舒伐他汀鈣對照品(歐洲藥品質量管理局，批號：Y0001719)；瑞舒伐他汀鈣雜質A對照品(TRC，批號：21-JHY-121-2)；瑞舒伐他汀鈣雜質B對照品(MC，批號：170224，非對映異構體)；瑞舒伐他汀鈣雜質C對照品(TLC，批號：2097-053A2)；瑞舒伐他汀鈣雜質D對照品((TRC，批號：2-CRD-105-1，5S-內酯)；瑞舒伐他汀鈣片自制片(批號：180711、180720，規格：10 mg)；瑞舒伐他汀鈣片進口片(阿斯利康制藥有限公司，批號：131408，規格：10 mg，商品名：可定)。甲醇、乙腈為色譜純，實驗用水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters CORTECS C18色譜柱(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流動相A為0.01 mol/L乙酸銨水溶液(用三氟乙酸調pH值至3.5)，B為乙腈，梯度洗脫(0～13 min，24%～36% B；13～17 min，36%～38% B；17～20 min，38%～62% B；20～25 min，24% B)；體積流量：0.6 mL·min-1；檢測波長：242 nm；柱溫40 ℃，進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取瑞舒伐他汀鈣對照品26 mg，精密稱定。置100 mL棕色量瓶中，加乙腈25 mL，振搖，待溶解后加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液；取儲備液適量加乙腈-水(25:75)制成每1 mL約含0.05 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品10片，置1000 mL棕色量瓶中，加250 mL乙腈和等量的水振搖超聲使溶解，再加水稀釋至刻度，超聲15 min，搖勻，放冷至室溫，過濾，棄去初濾液3 mL，取續濾液適量用乙腈-水(25:75)稀釋制成每1 mL約含0.05 mg的溶液，0.22 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.4 系統適用性試驗

稱取瑞舒伐他汀鈣對照品25 mg和雜質A、B、C、D各2.5 mg，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加乙腈-水(25:75)適量超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，取5 mL置25 mL棕色量瓶中，加乙腈-水(25:75)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性試驗溶液。同法配制單個雜質對照品定位溶液。取上述溶液，照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)按上述“2.1”項下色譜條件在242 nm波長處測定，分別各取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。瑞舒伐他汀峰與瑞舒伐他汀非對映異構體峰(雜質B)的分離度應大于1.5，瑞舒伐他汀峰的拖尾因子應小于1.2，理論塔板數不得低于10000。色譜圖見圖1。

圖1 瑞舒伐他汀鈣及雜質A、B、C、D對照品單個溶液及混合溶液HPLC圖

2.5 檢測波長的選擇

取本品標準曲線項下中間濃度的對照品溶液在二極管檢測器上檢測的210～400 nm波長范圍內掃描圖可知，本品在流動相中在241.5 nm處有最大吸收峰，同時參照本品已有國內外瑞舒伐他汀鈣原料和片劑標準含量測定波長多為242 nm，故本品HPLC法也采用242 nm作為含量測定的檢測波長。

2.6 線性關系考察

精密吸取對照品儲備液適量置25 mL棕色量瓶中，分別加乙腈-水(25:75)配成含瑞舒伐他汀30、40、50、60、70 μg·mL-1的對照品溶液，搖勻。照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)在242 nm波長處測定，流動相和梯度條件同上“2.1”項下，進樣10 μL，記錄色譜圖。以對照品質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制回歸曲線，回歸計算方程為Y=40795.19X+22306.72(r=0.9997，n=5)。結果表明，瑞舒伐他汀對照品溶液在30.01～70.03 μg·mL-1的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系，截距與標示濃度響應值百分比(B/Y%)為1.08%，小于2.0%，符合要求。

2.7 精密度試驗

取上述“2.6”項下中間濃度的對照品溶液，按照上述“2.1”項下色譜條件測定，連續進樣 6 次，記錄色譜圖，考察主峰峰面積和保留時間的變化情況，考察儀器精密度。可接受標準：RSD≤1.0%[7]。結果，峰面積和保留時間的RSD%分別為0.172%和0.028%，符合要求，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

按“2.4”項下供試品溶液制備方法，配制6份相同濃度的供試品溶液，按照“2.1”色譜條件測定，記錄色譜圖。同時用對照品溶液進行對照測定，按外標法以峰面積計算6份供試品溶液中含量的相對標準偏差，考察方法的重復性。可接受標準：RSD≤1.0%。結果，含量平均值為99.67%，RSD=0.42%，法重復性良好。

2.9 中間精密度實驗

對同一批次的瑞舒伐他汀鈣片(批號：180720)，在同一實驗室，分別在不同時間、不同儀器上，由不同實驗員操作，各平行配制6份，測定含量，對數據檢測結果進行統計分析，計算所得12個含量數據的相對標準偏差，驗證其中間精密度。可接受標準：RSD≤1.0%。按上述“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述“2.1”項下色譜條件測定。結果，12個含量數據平均值為 99.35%，RSD=0.66%。表明該方法中間精密度良好。

2.10 穩定性實驗

按上述“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫放置 0，1，2，4，6，8 h按照上述“2.1”項下色譜條件測定，記錄瑞舒伐他汀鈣峰面積。結果，峰面積RSD=0.08%。表明，瑞舒伐他汀鈣片含量測定供試品溶液在8 h內穩定。

2.11 回收率試驗

精密稱取空白輔料適量，精密加入一定量的瑞舒伐他汀鈣原料，按上述“2.4”項下供試品溶液制備方法操作(等比例縮小10倍)，使最終的樣品中含有的瑞舒伐他汀鈣(折干折純)濃度為標示濃度的80%，100%，120%，每個濃度平行操作3份。混合均勻，按上述“2.1”項下色譜條件測定，考察檢測方法的準確度。范圍：工作濃度的80%～120%。可接受標準：回收率應在98%～101%，RSD≤2.0%。實驗結果表明本法回收率較好，輔料對測定方法基本沒有影響。結果見表1。

表1 回收率試驗結果(n=3)

2.12 定量限實驗

取瑞舒伐他汀鈣對照品適量，用乙腈-水(25:75)逐步稀釋配制成一系列濃度的溶液，調試色譜儀，待基線平穩后精密量取不同濃度的對照品溶液各10 μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以信噪比為10:1作為本品定量限，并記錄色譜圖；結果本品的定量限濃度為0.077 μg·mL-1，約相當于含量測定供試品濃度的0.15%。

2.13 耐用性實驗

實驗考察了不同柱溫、不同流速、不同流動相初始比例、流動相 A 的不同 pH值條件、緩沖鹽濃度和3種不同廠家的液相色譜儀，計算瑞舒伐他汀鈣的含量，驗證該方法的耐用性。可接受標準：RSD≤2.0%。結果表明柱溫在±2 ℃范圍變化、流速在±0.05 mL·min-1范圍變化、流動相比例在±1范圍變化、流動相A的pH值在± 0.1范圍變化、緩沖鹽濃度±10%范圍變化，以及變更Waters Arc、賽默飛U3000、Waters 2695和安捷倫1260等3個廠牌4種型號的液相色譜儀，瑞舒伐他汀鈣含量穩定，RSD均小于1.0%，符合規定。表明該含量測定方法的耐用性良好。雖然改變流速、柱溫和流動相初始比例時，對主峰的保留時間影響較大，但不影響本品含量和雜質與主峰的分離度以及其他已知雜質分離度，說明本色譜條件耐用性較好。

2.14 樣品的含量測定

按上述“2.4”項下的供試品溶液及“2.2”項下的對照品溶液的配制方法，分別配制180720批樣品溶液和對照品溶液，各進樣10 μL，按上述“2.1”項下的色譜條件測定。按外標法以峰面積分別計算樣品中的瑞舒伐他汀鈣的含量，平行3 份，結果分別為100.01%、99.31%和99.90%，平均值為 99.74%，RSD 為0.38%。見圖2。

圖2 瑞舒伐他汀鈣片HPLC色譜圖

3 討 論

3.1 流動相的選擇

考察了1%三氟乙酸溶液-乙腈、水-甲醇-乙腈、0.01 M乙酸銨溶液-乙腈和0.02%三氟乙酸溶液-乙腈等四種流動相系統，結果水-乙腈-0.01 M乙酸銨溶液能使瑞舒伐他汀鈣與雜質B(非對映異構體)和雜質A得到基線分離，且能夠有效檢出雜質C、D和2個光降解雜質，峰型較好，各峰出峰時間早。因此，最終選擇流動相0.01 mol·L-1乙酸銨溶液(用三氟乙酸調pH值至3.5)-乙腈系統梯度洗脫達到目標產物與雜質基線分離。

3.2 系統適用性溶液的制備

因瑞舒伐他汀鈣在pH 1.0鹽酸溶液不穩定，降解生成瑞舒伐他汀非對映異構體(雜質B)、瑞舒伐他汀-5S-內酯(雜質D)和瑞舒伐他汀-5R-內酯，后兩者經堿中和處理后重新生成主成分及雜質B[3]。實驗過程中，取瑞舒伐他汀鈣對照品2.6 mg置50 mL棕色容量瓶中，加入1%的三氟乙酸25%乙腈溶液10 mL，搖勻，置50 ℃水浴加熱1 h，放冷，加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1.5 mL，搖勻，此溶液含有主成分和雜質B，再加入雜質A、C、D，用乙腈：水(25:75)配制成系統適用性溶液，此溶液雜質峰檢出明顯，更有利于考察色譜條件的分離效果和其他雜質的檢出情況，確保樣品中含有的雜質成分在含量測定條件下能夠完全分離和洗脫，避免多次進樣后鬼峰和饅頭峰的出現，確保含量測定結果的準確性。

3.3 供試品制備方法選擇

瑞舒伐他汀鈣見光不穩定，實驗過程中發現本品在紫外光365 nm、陽光和自然光條件下均有兩個光降解雜質峰產生，而在白熾燈和棕色瓶避光條件下均無光照峰產生(圖3)，依據光降解試驗結果供試品需避自然光操作或采用棕色瓶配制。另外采用原進口標準的方法對可定片(131408)研細后配制供試品測定結果偏低(95.44%)，而整片投料后配制供試品測定結果(99.23%)符合要求。故本品含量測定供試品配制應采用整片投料，棕色瓶避光操作。根據本品有關物質項下的研究結果顯示，雜質D在甲醇溶液中易降解生成雜質D-甲酯峰，故本品供試品配制溶劑不宜選擇甲醇，應采用不含醇羥基的乙腈水溶液進行配制，也進一步驗證本品處方工藝研究不宜采用含醇的濕法制粒壓片工藝，而應采用粉末直接壓片工藝。

圖3 光降解試驗HPLC圖譜

3.4 色譜柱的選擇

本實驗采用短的細粒徑色譜柱，與國內外標準(EP9.0原料標準和進口片劑標準JX20030283)使用長150 mm或250 mm的粗粒徑色譜柱相比(最后一個雜質D出峰在40～50 min)，具有出峰時間快(最后一個雜質D出峰在14～18 min)、分離效果好、柱效高的特點，大大縮短了分析時間，節省了溶劑；另實驗中比較了不同廠家不同品牌的細粒柱，按“2.4”項下系統適用性實驗進行雜質峰與瑞舒伐他汀鈣分離度考察。結果，沃特世色譜柱分離效果強，各降解峰均能檢出，降解物與主成分分離度符合規定。為保證方法的準確、可靠，本實驗規定采用Waters CORTECS(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)進行含量分析。

4 結 論

本文建立的瑞舒伐他汀鈣片的HPLC測定方法，經方法學實驗，其專屬性、重現性及回收率均較好，適用于以瑞舒伐他汀鈣片原料藥和成品的質量檢測。