優化鯽魚多肽提取工藝及其抗氧化能力的研究*

董倍余，張敏娟，黃曉霞，劉潤錦，吳功慶,3

(1 廣東藥科大學，廣東 中山 528458；2 河南地礦職業學院基礎部 河南 鄭州 450000； 3 廣東省化妝品工程技術研究中心，廣東 中山 528458)

近年來，水產源活性多肽的分離和純化技術越來越成熟，科研人員發現大量魚類含有抗氧化活性多肽，如羅非魚魚皮多肽[1]、鰱魚魚肉[2]、沙丁魚[3]等。魚類富含蛋白質分子，魚皮中的蛋白質含量更是高達70%，蛋白質酶解得到多肽，可見魚類是生物多肽極好的來源。

除了抗氧化功能以外，多肽還具有許多的作用，例如劉思聰研究發現毛蚶多肽能抗腫瘤[4]；新吉樂發現鹿茸多肽能回復線粒體的正常功能，清除細胞內堆積的過氧化物，抑制細胞額凋亡途徑，從而預防帕金森病[5]；內皮抑制素能抑制血管增生，從而起到抗腫瘤、抗類風濕病的作用，Xu等[6]根據內皮素的功能片段研制出多肽HM-3，可見多肽具有很大的開發空間。

鯽魚是我國重要的水產品之一，養殖規模大、養殖成本低，帶來了很高的經濟效益。雖然我國是淡水魚養殖大國，但是淡水魚加工程度不夠，大多都是鮮銷，利潤有限[7]。因此促進淡水魚深加工，提高淡水魚附加價值，提高經濟效益，是未來的研究方面。

本文通過酶解法，探究了木瓜蛋白酶在加酶量、溫度、酶解時間三個方面對鯽魚蛋白的酶解影響，同時對比了鯽魚多肽與抗壞血酸對羥基自由基的清除作用來研究鯽魚多肽的抗氧化能力，發現鯽魚多肽具有很好的抗氧化能力。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與設備

鯽魚購于中山市市場(鮮活)，去骨取肉，用純水清洗干凈后，吸干水分，將魚肉置于絞肉機中攪碎成肉糜，置于-4 ℃中保存備用。

試劑：木瓜蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；抗壞血酸，天津市天新精細化工開發中心；無水乙醇、過硫酸鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅等均為分析純，購于廣州化學試劑廠。

主要設備：721N分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；GZX-9240MBE恒溫培養箱、JA5003N千分之一天平，上海市佑科儀器儀表有限公司。

1.2 鯽魚酶解液的制備流程

取一定量鯽魚肉糜，按比例加入水和酶，調節pH；反應一段時間后滅酶、離心，取上清液，即為粗活性肽。

1.3 優化多肽提取工藝

1.3.1 單因素實驗

鯽魚多肽酶解過程中主要影響因素有加酶量、酶解時間、酶解溫度等。為了考察各因素對多肽酶解效果的影響，以加酶量(0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%)、酶解時間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)、酶解溫度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)作為考察因素，以DPPH自由基清除率作為試驗指標，進行單因素實驗。

1.3.2 響應面法確定最佳提取條件

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選取加酶量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)三個因素，以DPPH自由基半數消除率IC50值作為指標(Y)，對鯽魚多肽酶解工藝條件進行三因素三水平的響應面分析，確定最佳酶解條件。

1.4 分析方法

1.4.1 DPPH自由基清除率測定

參照文獻[8]有改動：將2 mL樣品溶液和2 mL 2 mmol/L DPPH溶液加入具塞試管中，搖勻，放置30 min，以無水乙醇為參比，測定吸光度為Ai；DPPH溶液和無水乙醇混合液的吸光度為Ac；樣品和無水乙醇混合液的吸光度為Aj。測定波長517 nm。

(1)

1.4.2 ABTS自由基的清除率測定

參照文獻[8]有改動：將配好備用的7 mmol/L的ABTS溶液和7.35 mmol/L的K2S2O8溶液，以ABTS溶液：K2S2O8溶液2:1的比例混合均勻。在使用前，用超純水稀釋，吸取0.70 mL，轉移到50 mL容量瓶中，定容。樣品加以上儲備液避光反應20 min，在734 nm處測吸光度。

(2)

式中：A1為樣品溶液和ABTS儲備液的吸光度值，A2為僅加樣品溶液不加ABTS儲備液的吸光度值，A0為僅加ABTS儲備液不加樣品溶液的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

稱取4 g鯽魚肉糜，置于燒杯中，加入12 mL蒸餾水，再加入0.9%木瓜蛋白酶，攪勻，在起初的水平面做標記，然后分別置于45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃中酶解1 h。然后將酶解液置于100 ℃水浴15 min，將殘留的酶滅活后，補水至起初做好標記的水平面，置于離心管中，4500 rpm離心15 min，取上清液，為粗活性肽。按1.4.1方法測定DPPH自由基清除效果重復3次，取平均值。溫度的影響如圖1所示，隨著溫度的升高，粗活性肽的抗氧化能力逐步上升，溫度55 ℃，抗氧化能力最佳，然后開始緩慢下滑。溫度太高，酶活性降低，不利于鯽魚多肽的酶解。

圖1 酶解溫度對消除率的影響

同理，分別加入0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%的木瓜蛋白酶，攪勻，然后置于55 ℃中酶解1 h，研究加酶量對粗活性肽抗氧化能力的影響(見圖2)。加酶量從0.3%到0.9%，清除率增加，加酶量大于0.9%，清除率反而降低。

圖2 加酶量對消除率的影響

圖3 酶解時間對消除率的影

固定加入0.9%木瓜蛋白酶，置于55 ℃中分別酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，研究酶解時間對DPPH自由基清除率的影響。結果如圖3所示，酶解時間越久，粗活性肽的抗氧化能力越高，3 h以后，抗氧化能力下降，酶解時間過長會使水分蒸發，還會降低多肽活性。

2.2 響應面法確定最佳提取條件

結合上述單因素分析結果，以上面3個因素為自變量，以DPPH半數清除率(Y)為響應值， 具體試驗設計方案和結果如表1所示。

表1 響應面實驗設計與結果

采用 Design Expert 8.0.6 軟件對試驗數據進行回歸分析，多元回歸擬合分析得到IC50與各因素變量的二次方程模型為：

IC50=4.00-0.25A-0.06B+0.28C-0.75AB+0.37AC-0.24BC-0.49A2-0.46B2-1.17C2

對表1實驗結果進行統計分析，得到的方差分析結果如表2所示。

表2 響應面二次模型方差分析

由表2可知，Prob>F的值小于0.05，說明該二次方程高度顯著，從回歸方程各項的方差分析結果還可以看出方程的失擬項較小，表明該方程對試驗擬合情況好、誤差小。根據所建立的數學模型進行分析，最佳的提取條件是：加酶量0.77%、酶解時間3.32 h、溫度為55.95 ℃，IC50預測值為4.05 mg/mL，修正為加酶量0.80%、酶解時間3.5 h、溫度為56 ℃，IC50實測值為4.06 mg/mL，說明數學模型對優化多肽提取工藝結果可靠。

圖4、圖5、圖6直觀地反映了各因素對響應值的影響。由圖4～圖6可知，溫度對多肽消除DPPH自由基的影響最為顯著，表現為曲線相對較陡；其次為加酶量，表現為曲線相對平滑；最后是酶解時間，曲線更平滑，隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。

圖4 時間與加酶量的交互作用

圖5 溫度與加酶量的交互作用

圖6 溫度與時間的交互作用

2.3 酶解液抗氧化能力測定

2.3.1 DPPH自由基消除能力

由圖7可知，抗壞血酸對DPPH清除能力極強，基本維持在95%左右，說明抗壞血酸的抗氧化能力極強。而鯽魚多肽的抗氧化能力隨著濃度的升高而升高，鯽魚多肽濃度為0.2 mg/mL時，DPPH清除只有35.3%；當鯽魚多肽濃度為1.0 mg/mL時，清除率高達83.5%，鯽魚多肽的抗氧化能力在一定范圍內與濃度成正比，且高濃度條件下抗氧化能力較強。

圖7 鯽魚多肽與VC消除DPPH自由基能力對比

2.3.2 ABTS自由基清除能力

由圖8可知，兩者抗氧化能力能隨著濃度增大而增強，且存在在比較穩定的差距。當酶解液濃度為0.8 mg/mL時，對ABTS的清除率也達到了56.8%，說明對鯽魚多肽ABTS也有一定清除能力，但是相比DPPH，清除率相對低一些。

圖8 鯽魚多肽與VC消除ABTS自由基能力對比

3 結 論

采用木瓜蛋白酶酶解鯽魚的提取工藝最適條件為加酶量0.8%、酶解時間3.5 h、溫度為56 ℃，在此條件下得到的IC50為4.06 mg/mL。提取工藝簡單、快捷，具有可推廣性。在一定條件下，鯽魚多肽隨著濃度的增大，對DPPH和ATBS的清除效率越大。通過與抗壞血酸對比發現，鯽魚多肽對DPPH有較好的清除率，但是對ABTS清除率稍差，整體來看，鯽魚多肽抗氧化能力較強。鯽魚多肽可以用作食品添加劑、抗氧化劑等，為提高鯽魚經濟效益提供了科學依據。