化學發光法檢測光動力過程單態氧相對產率實驗設計

許紫婷，陳 錚，劉 沈，王 建

（福州大學 化學學院，福建 福州 350108）

光動力學療法（photodynamic therapy，PDT）是20世紀70年代發展起來的癌癥治療手段，通過聯合利用光、光敏劑和氧分子的光動力反應選擇性地治療腫瘤、細菌感染、傳染病以及局部組織增生和感染[1-4]。福州大學自主研發的“福大賽因”新型抗癌光敏劑是酞菁類光敏劑的代表，目前已進入臨床Ⅱ期抗腫瘤試驗[5]。與其他放射治療相似，光動力治療中最關鍵的是劑量控制，單態氧（1O2）是 PDT過程中Ⅱ型光化學反應的主要毒性物質，因此，監測單態氧的量子產率成為目前PDT劑量學研究的前沿熱點[6-7]。化學發光法因其靈敏度高、檢測快速、儀器簡單等特點，被廣泛應用于活性氧（ROS）的測定，同時由于其化學反應和發光現象同時發生，有望成為一種在線動態分析不穩定化合物的有效手段[8-9]。

近年來，隨著本?；瘜W學科科研實力的不斷增強，本課題組不斷嘗試在實驗教學中引入學科前沿，將一些新的實驗技術、實驗方法轉化成教學實驗項目，不僅激發學生對科研的興趣，同時促進科研反哺教學[10]，而目前我?；瘜W實驗課程體系中涉及化學發光的實驗內容為空白。鑒于此，結合前期科研成果[11-12]，本文設計了應用化學發光法進行酞菁光動力過程單態氧的測定研究實驗。實驗中采用海螢熒光素類似物（MCLA）靜態化學發光法，通過Origin計算機軟件對發光體系延遲發光信號進行指數衰減非線性擬合數據處理，實現酞菁光敏劑在光照條件下單態氧的實時在線測定。實驗中引入學科前沿，將儀器分析、數據分析、物理化學及醫藥應用等不同學科內容結合在一起，具有新穎性、開放性、綜合性、易操作等特點，有利于學生更加有效學習和綜合運用基礎知識，培養自主探索精神，激發創新思維，提高創新能力。

1 實驗原理

酞菁光敏劑在 PDT中的作用主要以Ⅱ型機理為主[13]，如圖1所示：在一定波長光源照射下，預先注射體內后聚集在病變組織周圍的基態光敏劑（S0）吸收光子后，受激躍遷到激發態（S1），激發態光敏劑可通過輻射或非輻射躍遷回到基態，或者通過系間跨越（intersystem crossing，ISC）躍遷到激發三重態（T1），激發三重態的光敏劑可以和基態氧（3O2）發生能量交換（ET）產生具有生物毒性的活性氧（reactive oxygen species，ROS）或自由基等，與周圍的病變組織相互作用導致細胞凋亡或壞死。其中激發單態氧（1O2）被認為是Ⅱ型光動力學反應的主要毒性物質[14-15]。

圖1 光敏劑在PDT中的作用原理

實驗中采用 MCLA作為檢測單態氧的化學發光探針，在光照條件下，酞菁鋅（Z）光敏產生的單態氧與MCLA發生化學發光反應，光照停止后，由化學發光儀采集延遲的化學發光信號ICL，經 Origin計算機軟件非線性擬合后數據倒推，得到實時化學發光強度It，從而間接測定了反應中1O2的相對產率。

在溶液中，其主要反應有[16]：

其中：MCLA*為 MCLA氧化產物激發態，MCLA′為MCLA 氧化產物。

從反應式（3）可以得出，MCLA與1O2的化學計量學之比為 1∶1，且 MCLA*的生成速率與[MCLA]和[1O2]乘積成線性關系；從反應式（4）可以得出，化學發光強度正比于 MCLA*的生成速率，即正比于[MCLA]和[1O2]的乘積；在本實驗中[MCLA]?[1O2]，因此體系反應后的化學發光強度正比于[1O2]，即ICL可以線性地反映單態氧的相對產率。

2 藥品與儀器

試劑：酞菁鋅（Sigma公司）；海螢熒光素類似物MCLA（東京化成工業公司）；無水磷酸氫二鈉（分析純，阿拉丁試劑公司）；檸檬酸（分析純，阿拉丁試劑公司）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（分析純，阿拉丁試劑公司）。

儀器：BPCL型微弱發光分析儀（中國科學院生物物理研究所）；渦旋振蕩器（德國 IKA，VORTEX GENIE3）；電子天平（德國 Sartorius，BSA224S）；紅外燈（250 W）；移液槍；石英比色皿。

3 實驗方法

3.1 試樣準備

配制 6.00 mg·mL–1MCLA 儲備溶液；0.20 mg·mL–1MCLA 溶液（臨用前配）；1.00 mg·mL–1酞菁鋅儲備溶液；不同pH磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH=4.00，5.00，6.00，7.00，8.00）。

3.2 化學發光儀測定條件及測定方法

在石英比色皿中依次加入一定體積的緩沖溶液、DMF、MCLA溶液、酞菁鋅儲備溶液，并補水至總體積500 μL，振蕩均勻后立即放置在特定的紅外燈下照射一定時間t后，關閉光源并將比色皿轉移放入化學發光儀中，打開反應池與光電倍增管開關，用 BPCL軟件采集數據。所有實驗均在室溫下進行，實驗過程避免日光燈照射對實驗的影響，采用秒表精確控制時間，實驗測定裝置如圖2所示。

圖2 實驗測定裝置圖

3.3 數據處理

化學發光儀采集的原始發光數據是光照停止后的延遲化學發光信號ICL，如圖3(a)所示，光照時間為t，分別采集t=0、20和40 s后化學發光信號，光照停止后記錄化學發光信號ICL；為得到體系隨光照時間t變化的實時化學發光強度It，利用 Origin軟件對延遲發光信號進行指數衰減非線性擬合，擬合方程：

其中：y=ICL，x=t，x0、y0、A1、A2、τ1、τ2是與曲線相關的常數。

根據擬合后的方程將化學發光數據分別倒推至t=0、20、40 s時（即光照時間）所對應的實時化學發光強度It，最后以實時化學發光強度It為Y軸，光照時間t為X軸作圖，即得到體系單態氧相對產率隨光照時間的變化趨勢圖，如圖3(b)所示。

圖3 化學發光實測曲線與指數衰減非線性擬合處理后的曲線

4 結果與討論

4.1 影響化學發光體系靈敏度條件優化

圖4表示不同pH值對體系化學發光強度It的影響，在pH= 4.00~8.00 范圍內，MCLA均有明顯的發光信號，且發光強度It隨著 pH值的增大逐漸增加。MCLA在pH=7.00的條件下也具有較高的化學發光信號，表明MCLA是一類非常適合在生理pH值條件下檢測使用的化學發光探針。因此本實驗中選擇pH=7.00為最佳實驗條件。

圖4 pH值對體系化學發光強度的影響

圖5表示化學發光強度It隨DMF濃度的變化趨勢。研究表明[17]，酞菁鋅在水溶液中容易發生聚集，形成聚體，從而導致光敏活性降低，而在 DMF溶劑中酞菁鋅能以單體形式存在[18]。本實驗體系選用水和一定比例的 DMF作為溶劑，目的是在近似生理條件下進行實驗研究。從圖5可以看出，DMF在溶劑中的比例增加，有利于提高單態氧產率，說明 DMF在水溶液中對酞菁鋅具有解聚作用。隨著 DMF濃度的增加，酞菁鋅的聚集作用被減弱，體系產生活性氧的能力增強。因此，本實驗中選擇10% DMF水溶液作為溶劑最佳實驗條件。

圖5 DMF含量對體系化學發光強度的影響

圖6表示化學發光強度It與MCLA濃度的關系。從圖中可知，當 MCLA 濃度在 0~20 μg·mL–1范圍內增加時，化學發光強度It也逐漸上升，濃度低時上升速度快，濃度高時上升速度減緩；之后隨著MCLA濃度的繼續增加，化學發光強度It逐漸趨于平緩，且在30 μg·mL–1后基本不變。這是由于在酞菁鋅濃度不變的條件下，一定光照時間內酞菁鋅吸收傳遞給體系中溶解氧的能量是一定的，激發生成的活性氧濃度也是一定的，當體系中MCLA濃度足夠大，即[MCLA]?[1O2]時，化學發光強度It正比于單態氧濃度，且與MCLA濃度無關。因此，本實驗中選擇 MCLA濃度30 μg·mL–1作為最佳實驗條件。

圖6 MCLA濃度對體系化學發光強度的影響

4.2 光動力過程單態氧相對產率的測定

實驗條件下，利用實時化學發光強度的變化間接反映了體系反應過程單態氧相對產率隨光照時間的變化。同時，通過改變酞菁濃度，考察了單態氧相對產率與體系酞菁濃度之間的關系。圖7表示了不同酞菁初始濃度條件下化學發光強度It隨光照時間變化曲線。從圖中可以看出，在同一酞菁初始濃度條件下，單態氧相對產率隨光照時間先上升后下降，在光動力過程中，單態氧相對產率存在最大值，即體系存在最優光照時間。對于不同酞菁初始濃度條件下，其變化規律主要有3個：①單態氧相對產率最大值隨著酞菁濃度的增加先增后減，當酞菁濃度為 5 μg·mL–1時，體系整體單態氧相對產率最好；②酞菁濃度越大，體系單態氧相對產率越快到達最大值，即最優光照時間越短；③最優光照時間之后，酞菁濃度越大，單態氧相對產率下降越快。

圖7 不同酞菁初始濃度條件下化學發光強度It隨光照時間t變化曲線

在復雜化學反應中，中間產物的濃度在反應過程中出現極大值，是連續反應的突出特征[19]。單態氧作為本反應過程的中間產物，假設單態氧與MCLA反應生成 MCLA*過程為非體系反應的決速步驟，其反應過程簡化如圖8所示。

圖8 單態氧反應過程示意圖

在反應前期，體系中組織氧的濃度較大，因而生成單態氧的速率較快，單態氧的數量不斷增加。但是隨著反應繼續進行，組織氧的濃度逐漸減少，相應的生成單態氧的速率減慢。而另一方面，由于單態氧的濃度增大，進一步生成化學發光產物的速率不斷加快，使單態氧大量消耗，因而單態氧的數量反而下降，當生成單態氧的速率和消耗單態氧的速率相等時，就出現極大值，即實驗中測得的體系最佳光照時間數據。此外，結合圖7中單態氧相對產率的變化特點可知，適當增加酞菁光敏劑的濃度有利于提高單態氧相對產率，但高濃度酞菁鋅條件下，單態氧相對產率反而下降，這可能是由于高濃度酞菁鋅條件下，組織氧的迅速消耗及更大光敏劑的聚集率導致的。因此，實際應用時酞菁鋅光敏劑的劑量有一個最佳值。

綜上實驗結果表明：利用MCLA化學發光法可以實現光動力過程單態氧的實時在線監測，在優化了體系pH值、溶劑DMF含量和MCLA用量的實驗條件下，酞菁鋅光敏反應體系存在最佳光照時間和最佳光敏劑用量。本方法可以為光動力治療中最關鍵的劑量控制問題提供參考和指導。

4.3 實驗內容拓展

根據實驗教學和課時安排，本綜合實驗可拓展的實驗內容如下：

（1）采用DPBF（1,3 二苯基異苯并呋喃）紫外可見分光光度法輔助驗證光敏過程單態氧的生成，加深對實驗中關鍵知識點的理解。

（2）改變酞菁光敏劑的種類（如酞菁鋅、酞菁銅等），研究不同光敏劑的單態氧相對產率，篩選出性能良好的光敏劑。

（3）將該化學發光體系應用于光催化體系中活性氧的檢測，如二氧化鈦、氮化碳等光催化劑的活性氧分析研究。

5 結語

本實驗是對化學實驗課程體系中“化學發光法”的重要補充。通過實驗的嚴格訓練，學生不僅可以掌握化學發光分析法的原理及儀器操作技能，而且可以應用計算機軟件進行模擬計算，學會科學地處理實驗數據和合理地判斷分析方法，并在此基礎上進一步理解和掌握復雜反應體系的動力學理論。此外，本研究實驗注重綜合應用，與其他學科滲透交織廣泛，在近5年的綜合化學實驗教學實施中也發現，小組討論和總結匯報在實驗教學中非常有利于培養學生的科研探索和思維能力，促進教學相長。教師可以引導學生通過文獻查閱和小組討論等方式進行實驗探索，參與實驗設計和內容拓展。本實驗適宜開設為化學相關專業的本科綜合性教學實驗、研究生教學實驗或大學生創新訓練研究實驗。