微流控芯片測(cè)定癌胚抗原綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

高志剛，潘 悅，羅 勇，宋其玲，王世盛，汪 晴

（大連理工大學(xué) 國(guó)家級(jí)化工綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，遼寧 大連 116024）

近年來(lái)，隨著生命科學(xué)和信息科學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代科學(xué)儀器將成為今后發(fā)展的戰(zhàn)略重點(diǎn)之一。分析儀器作為發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分，將面臨新的機(jī)遇。與此同時(shí)，科學(xué)技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，使各個(gè)科研領(lǐng)域?qū)x器分析技術(shù)提出了更高的要求，如2020年的新冠病毒相關(guān)檢測(cè)，其分析方法不僅要求準(zhǔn)確、快速，同時(shí)還要盡可能降低測(cè)試成本，以滿足大規(guī)模人群病毒篩查的需求。現(xiàn)代分析儀器和方法逐漸向信息化、自動(dòng)化、微型化、便攜化、智能化的方向發(fā)展[1-4]。

微流控芯片技術(shù)興起于20世紀(jì)90年代，是在微米級(jí)通道結(jié)構(gòu)中對(duì)微升級(jí)至納升級(jí)液體進(jìn)行操控的技術(shù)，能夠?qū)⒍鄦卧夹g(shù)在微小可控平臺(tái)上靈活地組合和規(guī)模集成，也被稱為“建在芯片上的實(shí)驗(yàn)室”[5]。該技術(shù)圍繞生命科學(xué)開(kāi)展相關(guān)研究，在分析化學(xué)、生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)器件等相關(guān)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是化學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)、微電子學(xué)、環(huán)境檢測(cè)和微機(jī)械等一系列交叉學(xué)科的研究熱點(diǎn)[6-9]。

基于科教結(jié)合背景，同時(shí)為提升制藥工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量和促進(jìn)創(chuàng)新人才培養(yǎng)，我校微流控芯片研究團(tuán)隊(duì)總結(jié)多年的研究成果，以微流控芯片檢測(cè)技術(shù)和免疫學(xué)分析為學(xué)習(xí)重點(diǎn)，設(shè)計(jì)實(shí)施了癌胚抗原測(cè)定綜合性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，學(xué)生能夠熟悉玻璃微流控芯片的設(shè)計(jì)及制作方法，掌握磁性納米粒子的常規(guī)合成方法，以及紫外分光法和電鏡法等表征方法；掌握免疫標(biāo)記的修飾方法，并學(xué)習(xí)抗體與金納米顆粒偶聯(lián)方法；利用抗原-抗體特異性結(jié)合來(lái)測(cè)定肺癌標(biāo)記物-癌胚抗原在生物樣本中的濃度，以此作為輔助診斷肺癌方法，提升學(xué)生對(duì)理論與實(shí)踐、知識(shí)與技術(shù)的整合運(yùn)用能力。

1 實(shí)驗(yàn)原理

拉曼光分析法基于拉曼散射效應(yīng)，通過(guò)對(duì)散射光譜進(jìn)行系統(tǒng)分析，獲得分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面的信息。目前較認(rèn)可的原理為散射光與入射光頻率相同稱為瑞利散射，與入射光頻率不同稱為拉曼散射，對(duì)稱分布在瑞利線兩側(cè)的分別稱為斯托克線（瑞利線低頻一側(cè)）和反斯托克線（瑞利線高頻一側(cè)）。激發(fā)光與此分子的作用引起的極化可以看作為虛的吸收，表述為電子躍遷到虛態(tài)，虛能級(jí)上的電子躍遷到下能級(jí)而發(fā)光[10]。

在通常情況下，拉曼散射效應(yīng)非常弱，幾乎都要利用某種增強(qiáng)效應(yīng)來(lái)提高該方法的靈敏性，由此產(chǎn)生了表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）效應(yīng)。它是在特殊制備的一些金屬良導(dǎo)體表面或溶膠中, 吸附分子的拉曼散射信號(hào)比普通拉曼散射信號(hào)大大增強(qiáng)的現(xiàn)象。其增強(qiáng)機(jī)理主要包括電化學(xué)增強(qiáng)和磁場(chǎng)增強(qiáng)等。隨著 SERS技術(shù)的逐漸成熟，其在生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境、農(nóng)藥殘留和免疫學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用也越來(lái)越多[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)中將 SERS與標(biāo)記免疫學(xué)相結(jié)合，利用SERS靈敏度高的特性，以抗體-抗原的特異反應(yīng)捕獲生物樣本中的癌胚抗原。實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，所制備的免疫金溶膠和磁性抗體，能夠與待測(cè)樣品中抗原特異性結(jié)合，形成夾心免疫復(fù)合物，并通過(guò)其上的拉曼探針?lè)肿有盘?hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。同時(shí)還將磁性納米粒子應(yīng)用于免疫檢測(cè)，其最大優(yōu)勢(shì)是在外加磁場(chǎng)作用下，樣品能快速地富集，在短期內(nèi)能得到濃縮和純化，有助于提高檢測(cè)效率、縮短檢測(cè)時(shí)間[14]。磁性納米粒子具有較高的比表面積，可以通過(guò)修飾提供足夠多的表面結(jié)合位點(diǎn)來(lái)與抗體等生物分子結(jié)合，從而提高檢測(cè)的靈敏度[15]。

圖1 微流控芯片檢測(cè)原理圖

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 芯片的制作

本實(shí)驗(yàn)選擇光學(xué)玻璃作為芯片材料，玻璃材質(zhì)具有良好的光學(xué)特性，經(jīng)光刻和蝕刻等工藝可以得到三維微結(jié)構(gòu)，且對(duì)生物大分子樣品不存在潛在毒性。玻璃芯片的基片包括S-1805光刻膠（厚度570 nm）、鉻保護(hù)層（厚度145 nm）、光學(xué)玻璃等，制作工藝包括掩膜的制作、曝光、顯影、刻蝕、打孔、去保護(hù)層、清洗及表面活化、熱鍵合等8個(gè)步驟。

2.2 免疫金溶膠的制備

經(jīng)無(wú)水乙醇和去離子水超聲清洗過(guò)的 1.5 mL離心管中，加入1 mL的35 nm Au，5 000 r/min速度離心約15 min（下同），棄上清液后加入1 mL硼砂緩沖液，然后加入6 μL的0.1 mmol/L的4,4′-聯(lián)吡啶，在振蕩器上混勻后搖床上溫育10 min，取出后離心，棄上清液后加入1 mL硼砂緩沖液，用微量進(jìn)樣器取6.7 μL的2.7 mg/mL的CEA抗體，振蕩器混勻后溫育3.5 h，取出離心棄上清液后加入1 mL的硼砂緩沖液，再加10 μL的牛血清白蛋白（BSA）。混勻后溫育1 h，取出離心棄上清液后，加入1 mL硼砂緩沖液，得到拉曼標(biāo)記免疫金溶膠，放入冰箱保存待用。

2.3 Fe3O4@Au-抗體溶液的制備

2.3.1 Fe3O4的合成

由于實(shí)驗(yàn)中需要水溶性好、鐵磁性高的磁性納米粒子，故選擇溶劑熱法合成 Fe3O4磁性粒子。稱取0.65 g的FeCl3和0.2 g的檸檬酸鈉，加入20 mL的乙二醇（還原劑）超聲震蕩0.5 h后，在機(jī)械攪拌條件下緩慢加入1.2 g無(wú)水醋酸鈉，待固體全部溶解后繼續(xù)攪拌 3 h，后轉(zhuǎn)移至四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，并在200 ℃下反應(yīng)10 h。待其冷卻至室溫后，用去離水洗滌多次，最后分散在20 mL水溶液中待用。

2.3.2 Fe3O4氨基化修飾

取1 mL合成的Fe3O4水溶液，溶于50 mL無(wú)水乙醇中，超聲分散5 min后加入110 μL的3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS），再超聲15 min分散均勻。常溫下機(jī)械攪拌12 h，停止后超聲15 min，冷凝回流2 h。冷卻至室溫后，用無(wú)水乙醇磁分離洗滌8次除去溶液中未連接上的APTMS，最后分散在15 mL乙醇中備用。

2.3.3 Fe3O4@Au的合成

取45.5 mL超純水于100 mL的廣口瓶中，分別加入1.5 mL的0.2 mol/L氫氧化鈉水溶液，1 mL四羥甲基氯化磷稀釋液（1.2 mL稀釋至100 mL的水溶液）。常溫下磁力攪拌5 min后，逐滴緩慢加入2 mL的1%氯金酸溶液（1 g的四水合氯金酸溶于100 mL超純水中），溶液逐漸由無(wú)色變?yōu)樽虾谏３財(cái)嚢? h后停止攪拌，放入冰箱待用。加入已經(jīng)氨基化修飾的15 mL Fe3O4-乙醇溶液與25 mL的2 nm Au混合，超聲并室溫下機(jī)械攪拌 24 h，用水磁分離洗滌多次，得到Fe3O4-2 nm Au，并分散在15 mL超純水中。

取上述制備的Fe3O4-2 nm Au溶液2 mL轉(zhuǎn)入到盛有16 mL 1%的氯金酸溶液中，超聲分散后，在機(jī)械攪拌下逐滴加入2 mL甲醛溶液，溶液逐漸變?yōu)樗{(lán)色，磁分離洗滌后分散在4 mL硼砂溶液中，得到Fe3O4@Au存入冰箱待用。

2.3.4 Fe3O4@Au與CEA抗體復(fù)合物的制備

在用乙醇和去離子水超聲清洗過(guò)的4 mL離心管中取1 mL的Fe3O4@Au溶液，加入6.7 μL的CEA抗體，混勻后溫育4 h，磁洗后棄上清液，加入1 mL硼砂緩沖液，以及10 μL的10%BSA，溫育1 h后取出磁洗后棄上清液，加入1 mL硼砂緩沖液，放入冰箱待用。

2.4 SERS與標(biāo)記免疫學(xué)的CEA檢測(cè)

將制備好的1 mL磁性癌胚抗原抗體從芯片左側(cè)進(jìn)樣口通過(guò)注射泵緩慢注入芯片內(nèi)，將1 mL已經(jīng)連接 4,4-聯(lián)吡啶拉曼探針的免疫金從右側(cè)進(jìn)樣口通過(guò)注射泵注入芯片內(nèi)，1 mL的CEA抗原稀釋液從中間進(jìn)樣口注入芯片內(nèi)，3個(gè)注射泵流速設(shè)置為0.2 mL/h。1 h后，將超純水從芯片中間進(jìn)樣口注入芯片內(nèi)，清洗通道10 min后進(jìn)行拉曼檢測(cè)。

檢測(cè)設(shè)備為激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，檢測(cè)參數(shù)設(shè)置為激光波長(zhǎng)633 nm，激光功率5 mW，10倍物鏡，曝光時(shí)間1 s，積分次數(shù)20次。每次檢測(cè)前，用硅片校正儀器參數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 玻璃芯片的結(jié)構(gòu)尺寸

實(shí)驗(yàn)中玻璃芯片制備所用的掩膜，均由FreeHand軟件完成微通道結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，掩膜尺寸63 mm×63 mm，通道尺寸500 μm×80 μm，長(zhǎng)度為15 cm，按掩膜用光刻蝕與濕法刻蝕結(jié)合制備出的玻璃芯片如圖2所示。在用聚二甲基硅氧烷（PDMS）材質(zhì)制作的通道接口處固定3個(gè)長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)臉岊^，以便注射樣品。S型通道是樣品進(jìn)行混沌混合的區(qū)域，經(jīng)過(guò) 4個(gè)彎道的混合，樣品之間充分接觸和反應(yīng)，反應(yīng)后的溶液在流經(jīng)固定有圓形小磁鐵的集液槽時(shí)，磁性復(fù)合納米粒子被外部磁場(chǎng)吸附而停留，剩余的溶液則經(jīng)廢液槽排出通道。

圖2 玻璃芯片檢測(cè)實(shí)物圖

3.2 Fe3O4@Au粒子表征

合成的 Fe3O4磁性粒子水溶液呈棕黃色，粒子濃度范圍為12～13 mg/mL，對(duì)其進(jìn)行磁性考察。在裝有粒子的帶塞錐形瓶側(cè)邊放一塊方形磁鐵，粒子能很快被吸附到側(cè)邊且溶液澄清，說(shuō)明所制備的粒子磁性能好，能被磁鐵快速吸附而從溶液中分離出來(lái)。

圖3是Fe3O4@Au粒子的紫外吸收光譜圖，由圖可知，F(xiàn)e3O4粒子并沒(méi)有特征吸收峰，而包裹了金殼之后，在578 nm處出現(xiàn)了特征吸收峰，與金粒子紫外光譜圖相比，出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象。這是因?yàn)?Fe3O4@Au粒子形成之后，Au粒子中的電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，Au殼表面出現(xiàn)電子缺失，引起吸收峰紅移。

圖3 Fe3O4@Au紫外光譜圖

Fe3O4@Au還利用透射電鏡表征，如圖 4所示，金包被完全的粒子，本實(shí)驗(yàn)采用種子生長(zhǎng)法，是由已經(jīng)連有2 nm Au的Fe3O4繼續(xù)用甲醛緩慢還原出Au粒子，在機(jī)械攪拌下，還原出來(lái)的 Au粒子能比較均勻地在Fe3O4粒子表面生長(zhǎng)。

圖4 Fe3O4@Au透射電鏡譜圖

3.3 癌胚同抗原的SERS檢測(cè)

3.3.1 拉曼探針特征峰表征

在免疫檢測(cè)中為了使檢測(cè)信號(hào)更加清晰，常需要在實(shí)驗(yàn)中加入標(biāo)記分子，常用的拉曼探針標(biāo)記分子有苯硫酚、對(duì)巰基苯甲酸、對(duì)巰基苯胺、4,4′-聯(lián)吡啶等，苯硫酚是單官能團(tuán)的標(biāo)記分子，官能團(tuán)和抗原或抗體將 Au溶膠混合連接；對(duì)巰基苯甲酸和對(duì)巰基苯胺是雙官能團(tuán)標(biāo)記分子，巰基與 Au溶膠顆粒連接后，另外一個(gè)官能團(tuán)能與抗原和抗體相連，增加了共軛效應(yīng)；4,4′-聯(lián)吡啶可以在金屬表面促進(jìn)特定分子的氧化反應(yīng)，從而自組裝成單分子層，它可以作為良好的標(biāo)記分子，應(yīng)用到SERS技術(shù)中。實(shí)驗(yàn)中選用4,4′-聯(lián)吡啶作為標(biāo)記分子，在 Au溶膠表面連接的 4,4′-聯(lián)吡啶數(shù)量越多，則拉曼信號(hào)越強(qiáng)。拉曼信號(hào)特征譜圖如圖 5所示，確定3個(gè)特征峰，1 000 nm-1為不飽和碳?xì)涞拿鎯?nèi)彎曲振動(dòng)，1 299 nm-1為飽和碳?xì)涞拿鎯?nèi)彎曲振動(dòng)，1 617 nm-1為碳-碳鍵的伸縮振動(dòng)。

圖5 4,4?-聯(lián)吡啶拉曼信號(hào)特征譜圖

3.3.2 拉曼探針加入量對(duì)信號(hào)的影響

考慮到標(biāo)記分子的加入量與標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間會(huì)對(duì)拉曼信號(hào)的強(qiáng)度造成影響，所以對(duì)標(biāo)記分子的加入量與標(biāo)記時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。首先是標(biāo)記分子的加入量?jī)?yōu)化，取6支1.5 mL離心管，分別加入1 mL的35 nm的Au溶膠離心，去除上清液后加入1 mL硼砂緩沖溶液，分別加入 1.5、3、4.5、6、7.5、9 μL的 0.1 mmol/L的4,4′-聯(lián)吡啶反應(yīng)10 min，離心去除上清液加入1 mL硼砂緩沖溶液，分別取200 μL進(jìn)行拉曼信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)得出，當(dāng)4,4′-聯(lián)吡啶的加入量為6 μL時(shí)，其拉曼信號(hào)強(qiáng)度最大，所以確定標(biāo)記分子的加入量為6 μL。

3.3.3 標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間對(duì)拉曼信號(hào)的影響

對(duì)標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間T進(jìn)行優(yōu)化。取6支1.5 mL離心管，分別加入1 mL的35 nm Au溶膠，離心后去除上清液，分別加入 1 mL硼砂緩沖溶液和 6 μL的0.1 mmol/L 的 4,4′-聯(lián)吡啶，分別反應(yīng) 5、10、30、60、120 min后，然后離心去除上清液加入1 μL硼砂緩沖溶液，分別取200 μL進(jìn)行拉曼信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)，如圖6所示，可以看出，反應(yīng)時(shí)間在0～30 min內(nèi)，拉曼信號(hào)的強(qiáng)度逐漸減弱，考慮到操作的簡(jiǎn)便性，故取標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間為10 min。

圖6 反應(yīng)時(shí)間與拉曼強(qiáng)度關(guān)系

3.3.4 拉曼檢測(cè)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)中，依次配置 1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL 和 10 μg/mL等不同癌胚抗原濃度樣品，拉曼檢測(cè)結(jié)果如圖 7所示，可以發(fā)現(xiàn)，隨著樣品濃度的不斷增加，特征峰強(qiáng)度也隨之增加。選擇1 617 nm-1信號(hào)強(qiáng)度，建立濃度與特征峰之間曲線關(guān)系，結(jié)果表明在樣品濃度1 pg/mL至10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好。

圖7 不同濃度下拉曼信號(hào)趨勢(shì)圖

4 結(jié)語(yǔ)

本綜合性實(shí)驗(yàn)是由教師科研成果經(jīng)總結(jié)提煉后轉(zhuǎn)化而來(lái)，與傳統(tǒng)制藥工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)相比，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋多學(xué)科知識(shí)，具有探究性和前瞻性。同時(shí)綜合性實(shí)驗(yàn)的操作難度大、實(shí)驗(yàn)要求高、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，因此在教學(xué)過(guò)程中要因地制宜結(jié)合學(xué)生情況開(kāi)展，從而促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式改革。此外，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，擴(kuò)展了微流控芯片技術(shù)以及納米材料在免疫、生化等領(lǐng)域的應(yīng)用。