兩種新型冠狀病毒抗體檢測試劑的臨床應用評價

寧樂平，劉曉春△，姜偉豪，吳榮才，黃日江，陽文輝

1.廣西壯族自治區人民醫院檢驗科，廣西南寧 530000;2.廣西壯族自治區人民醫院邕武院區檢驗科，廣西南寧 530000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳染性強，其核酸檢測是目前診斷SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的金標準，但核酸檢測存在假陰性率高、操作繁瑣、耗時長、測定結果易受多種因素影響等缺點，而且核酸單項檢測不能滿足疫情期間對疑似病例快速篩查的要求。隨著臨床對COVID-19診療經驗的積累，最新有研究指出，SARS-CoV-2抗體+核酸聯合檢測能夠彌補核酸檢測準確性的不足，而且基于膠體金免疫層析技術(GICA)檢測SARS-CoV-2抗體突破了現有檢測技術對人員、場所、儀器的限制，縮短檢測時間，操作方便快速，在基層醫療單位及現場檢測中被廣泛應用[1-6]。本文對廣州萬孚生物科技有限公司(簡稱萬孚)和英諾特(唐山)生物科技有限公司(簡稱英諾特)生產的GICA試劑檢測SARS-CoV-2總抗體、IgM、IgG的能力進行評價?，F將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月16日至3月1日在廣西壯族自治區人民醫院邕武院區經核酸檢測陽性的COVID-19確診患者69例作為確診病例組，確診患者均符合文獻[2]診斷標準，其中男16例、女53例，平均年齡為(43.7±14.5)歲，從發病到采樣時間最短為10 d，最長為46 d，平均(30.3±8.3)d。另選取同期在廣西壯族自治區人民醫院邕武院區排除SARS-CoV-2感染的38 例體檢人員作為陰性對照組，其中男8例、女30例，平均年齡為(40.2±7.4)歲。陰性對照組為無COVID-19相關臨床癥狀且經過兩次鼻咽拭子核酸檢測陰性(兩次檢測時間間隔至少1周)。確診病例組和陰性對照組在性別及年齡分布方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究遵守國際協調理事會臨床試驗規范和赫爾辛基宣言，經醫院倫理審查委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1標本采集 所有研究對象均采集空腹靜脈血3 mL，置于真空采血管內，靜置待血液凝固，3 500 r/min離心10 min，取血清備用。采集研究對象鼻咽拭子進行SARS-CoV-2核酸的檢測。

1.2.2SARS-CoV-2抗體檢測 采用萬孚生產的GICA試劑(批號：W19500206)檢測血清SARS-CoV-2總抗體(不能區分IgG和IgM)，檢測針對棘突蛋白(S蛋白)抗體。同時，采用英諾特生產GICA試劑(批號：20200205)檢測血清IgG和IgM，檢測針對S蛋白和核衣殼蛋白(N蛋白)抗體，該試劑可以區分IgG和IgM。檢測操作步驟參考試劑說明書。

1.2.3SARS-CoV-2核酸檢測 實時熒光定量聚合酶鏈反應儀(ABI Prism 7500)購自美國ABI公司，核酸提取試劑盒購自湖南圣湘生物科技股份有限公司(批號：202003)，使用湖南圣湘生物科技股份有限公司生產的Natch S全自動核酸提取系統進行核酸提取。擴增試劑盒購自湖南圣湘生物科技股份有限公司(批號：202007)，針對SARS-CoV-2 編碼ORF 1ab 及N 蛋白基因的特異性保守序列為靶區域，進行了雙靶標基因的設計。實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測體系包含有內源性的內標引物和探針，通過是否檢出內標來判斷標本是否合格，減少假陰性結果。

2 結 果

2.1萬孚與英諾特試劑、核酸檢測診斷效能比較 萬孚總抗體和英諾特IgG聯合IgM 的診斷效能比較見表1。確診病例組中萬孚總抗體、英諾特IgM、英諾特IgG、英諾特IgG聯合IgM陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；陰性對照組中萬孚總抗體、英諾特IgM、英諾特IgG、英諾特IgG聯合IgM陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 萬孚與英諾特試劑、核酸檢測診斷效能比較

2.2萬孚總抗體和英諾特IgM聯合IgG診斷性能比較 萬孚總抗體和英諾特IgM聯合IgG一致性檢驗kappa值為0.918(P<0.05)，說明萬孚總抗體和英諾特IgM聯合IgG兩種結果間的一致性程度好。見表2。

表2 萬孚總抗體與英諾特IgM聯合IgG診斷性能比較(n)

2.3陰性對照組中3例患者SARS-CoV-2抗體與核酸檢測結果不一致 本研究陰性對照組中3例患者SARS-CoV-2抗體與核酸檢測結果不一致，2例患者出現“兩次核酸陰性+萬孚總抗體陰性+英諾特IgM弱陽性+英諾特IgG陰性”的結果，1例患者出現“兩次核酸陰性+萬孚總抗體陰性+英諾特IgM陰性+英諾特IgG弱陽性”的結果。此外，確診病例組有4例患者出現SARS-CoV-2核酸檢測復陽，這4例患者的萬孚總抗體均為陽性，說明患者體內存在針對S蛋白的抗體。

2.4確診病例組SARS-CoV-2抗體出現與消失的時間 確診病例組英諾特IgG抗體產生率100%。確診病例組中，英諾特IgM最早轉陰的時間為13 d，最長持續時間大于46 d，具體能持續多長時間有待后續隨訪跟蹤。英諾特IgG最早小于10 d產生，最早25 d轉陰。

3 討 論

GICA試劑檢測SARS-CoV-2抗體的方法，在流行病學調查的方面有其獨特的優勢。本研究使用萬孚和英諾特生產的GICA試劑檢測SARS-CoV-2抗體，靈敏度和特異度均較高，高于羅效梅等[7]采用的江蘇美克醫學技術有限公司生產GICA試劑檢測SARS-CoV-2的IgM聯合IgG的靈敏度(92.1%)、特異度(90.7%)，以及梁穎等[8]、SHEN等[9]報道的IgG聯合IgM的靈敏度和特異度。可能與不同研究中的患者數量、人群不同有關。

抗體檢測可以彌補核酸檢測靈敏度的不足，但抗體檢測也存在一定比例的“假陽性”。類風濕因子、補體、嗜異性抗體、溶菌酶、使用鼠抗體治療等內源性因素，以及標本溶血、儲存時間過長、凝固不全等分析前因素，都可以導致“假陽性”[6]。

陰性對照組中3例英諾特IgG和IgM與核酸檢測結果不一致的可能原因如下：(1)2例患者英諾特IgM弱陽性，存在“初次感染載量極低的SARS-CoV-2并處于感染早期，病毒載量低于核酸檢測下限，機體產生少量IgM，尚未產生IgG”的可能性，但是2例患者均無任何COVID-19的癥狀、CT無陽性表現、相隔1周的兩次核酸檢測陰性，綜合考慮是英諾特IgM假陽性；(2)另外1例英諾特IgG弱陽性，可能存在“既往感染SARS-CoV-2，但已恢復或體內病毒被清除，免疫應答產生的IgG維持時間長，仍存在于血液中而被檢測到”的可能性，但是該患者無任何COVID-19的癥狀、CT無陽性表現、相隔1周的兩次核酸為陰性、萬孚總抗體陰性，綜合考慮是英諾特IgG假陽性。以上3例英諾特IgM或IgG假陽性，可能是檢測N蛋白抗體的假陽性所致。英諾特試劑檢測S蛋白和N蛋白的抗體，而萬孚試劑檢測S蛋白抗體。如果患者體內僅存在干擾N蛋白抗體的物質，就可導致萬孚總抗體陰性而英諾特IgM或IgG陽性的結果。反之，如果患者只有針對N蛋白的抗體，萬孚總抗體存在一定漏診的風險。

SARS-CoV-2暴發于上呼吸道感染流行季節，hCoV-NL63，hCoV-OC43，hCoV-229E，hCoV-HKU1感染引起的上呼吸道感染患者可影響SARS-CoV-2抗體的檢測結果[10-15]。被SARS-CoV-2感染過的患者體內是否存在與N蛋白或S蛋白有交叉反應的抗體，是抗體檢測中面臨的重要問題。S蛋白是介導病毒進入細胞內的關鍵蛋白[13]。ZHENG等[14]通過生物信息學技術推測 S蛋白可能是未來治療性抗體和疫苗的潛在靶點。

本研究出現4例SARS-CoV-2核酸檢測復陽的患者，萬孚總抗體均為陽性，說明患者體內存在針對S蛋白的抗體。體內存在針對S蛋白的保護性抗體，還出現核酸檢測復陽，考慮可能原因如下：(1)針對S蛋白的抗體不一定是保護性抗體；(2)針對S蛋白的抗體是保護性抗體，但是針對某一特定氨基酸序列的，而被萬孚試劑檢測出的S蛋白抗體不是針對這一特定的氨基酸序列?？傊?，抗體的“假陽性”問題，是限制抗體用于COVID-19確診的關鍵因素。目前，抗體檢測主要用于疑似病例的確診或排除[4]。對于不滿足疑似病例標準的病例，抗體不作為診斷和排除依據。

本研究受多種條件限制，存在許多不足之處。例如標本數量有限，可能對分析結果的準確性產生影響；其次，收集的病例多為確診10 d以上的病例；另外，對于陰性對照組的假陽性病例追蹤時間不夠久，可能準確性不足。因此需要通過多中心、大規模的臨床驗證，進一步明確抗體檢測在SARS-CoV-2感染診斷中的價值。