GSK-3β抑制劑對糖尿病腎病大鼠腎組織病理、NF-κB及TGF-β1的影響

王雪梅，陳海青

中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八一醫院質量管理控制科，河北承德 067000

糖尿病腎病(DN)已成為我國除心臟疾病外的第二大疾病，臨床癥狀主要為身體水腫和尿蛋白水平升高，而糖尿病作為一種代謝性疾病，使患者身體健康受到損傷，還會引起各種并發癥，給患者心理和生理造成極大的負擔[1-2]。糖尿病引起的腎損傷十分常見，主要表現在腎功能衰退會減少降糖物質的排泄，藥物在機體內停留時間增加，這些藥物大多數都在腎臟排泄，腎負擔加重[3]。據不完全統計，我國每年由糖尿病患者轉為DN患者的概率為三分之一，并有部分患者病情加重，甚至發展到腎病終期[4]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)作為調節細胞增殖及分化的重要因素，參與了許多生理學和病理學過程，可引起細胞外矩陣和基底膜的分解，DN患者腎損傷程度受TGF-β1表達水平影響[5]。隨著醫學領域的不斷發展，核因子-κB(NF-κB)成為研究熱點。作為核轉錄中最重要的因子之一，NF-κB參與了細胞的凋亡及炎性反應，炎癥信號最先轉入細胞膜中，通過細胞中I-κB激酶等途徑增加NF-κB活性進行特異性識別，出現基因轉錄和調控引發病變[6-7]。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是涉及多個細胞信號傳輸路徑的絲/蘇氨酸激酶，其生物學功能復雜，除了參與糖代謝之外，GSK-3β還涉及細胞分化、增殖、炎性反應等過程。近年研究發現，GSK-3β抑制劑可減輕胰島素抵抗，在DN的臨床治療中效果明顯[8]。由此，本文探討GSK-3β抑制劑對DN大鼠腎組織病理、NF-κB及TGF-β1的影響。

1 材料與方法

1.1模型建立和分組 將購自廣東省醫學實驗動物中心的36只體質量為0.20～0.25 kg的SD大鼠隨機分為Tz組(DN模型)、Ty組(GSK-3β抑制劑干預)和Wt組，各12只。Wt組大鼠正常飼養，Tz組、Ty組大鼠采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射，建立DN動物模型(不予喂食，空腹3 d后抽取大鼠尾部靜脈血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L視為合格糖尿病模型)。

1.2儀器與試劑 美國ENZO公司生產的STZ，AVIVA公司生產的小鼠抗NF-κB單克隆抗體，蘇州巨能科技公司羊抗兔IgG，上海Superchip technology公司生產的實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒等。

1.3方法

1.3.1干預及24 h尿蛋白測定 Ty組大鼠采用GSK-3β抑制劑(氯化鋰)干預，Wt組及Tz組(DN模型)采用等量生理鹽水腹腔注射。3組大鼠均繼續飼養12 d。24 h尿蛋白定量處死大鼠前，收集3組大鼠禁食(正常喝水)24 h后的尿液，測定24 h尿蛋白。

1.3.2蘇木精-伊紅(HE)染色 將大鼠處死，取出雙腎，甲醛溶液固定腎組織，乙醇溶液脫水，石蠟包埋后切片(厚度4 μm)，山羊血清封閉，蘇木精和伊紅染液復染，時間分別為6～8 min和10 s，于顯微鏡下觀察Wt組、Tz組、Ty組腎組織結構改變情況。24 h大鼠的尿標本，運用Bradford法進行檢測。

1.3.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測NF-κB表達水平 取腎組織，加入裂解液，制備組織勻漿，采用Trizol法提取總RNA。將總RNA反轉錄成cDNA，以β-actin為內參，按說明書進行實驗，試劑盒購自上海Superchip technology公司生產的。反應條件：60 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，95 ℃ 5 min，循環次數40次，實驗次數至少3次，用2-ΔΔCt計算NF-κB、TGF-β1的mRNA表達水平。見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.4免疫組化檢測TGF-β1表達 取石蠟包埋的腎組織，切片(厚度5 μm)，乙醇溶液脫水，滴加抗原消化液、修復液，應用山羊血清封閉，按1∶50加入一抗及二抗，恒溫箱孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次，選擇3,3′-二氨基聯苯胺染色，利用蒸餾水終染，蘇木精襯染，脫水后可烘干，腎組織棕(褐)色為TGF-β1陽性表達，于光鏡下進行觀測。

1.3.5Western blot法檢測NF-κB、TGF-β1變化 取石蠟包埋的腎組織，使用PBS洗滌，將1 mL裂解液與切碎的腎組織混勻，對腎組織勻漿進行蛋白測定，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)100 V電泳，Bradford法可來定量電泳產物，再移至PVDF膜，10%山羊血清封閉操作，一抗過夜4 ℃下孵育，待二抗孵育完畢后，使用TBST漂洗2遍，TBS漂洗1遍，每次10 min。使用增強化學發光法試劑來檢測蛋白，暗室內曝光，Quantity One 4.0軟件分析，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作內參，檢測NF-κB、TGF-β1蛋白變化。

2 結 果

2.13組大鼠24 h尿蛋白定量 Tz組及Ty組大鼠24 h尿蛋白水平[分別為(118.53±21.68)mg/24 h、(76.54±10.23)mg/24 h)]均高于Wt組[(12.66±2.57)mg/24 h]，Ty組大鼠24 h尿蛋白水平低于Tz組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2HE染色結果比較 Wt組大鼠腎組織內細胞結構、形態較完整，未觀察到增生、肥大的細胞。Tz組大鼠腎小球、系膜基質生長異常，毛細血管管腔、腎小管管腔凹陷、阻塞，伴有水腫間質。Ty組大鼠腎小球和腎小管病變程度較Tz組有明顯好轉。見圖1。

注：A為Wt組大鼠腎組織染色圖;B為Tz組大鼠腎組織染色圖；C為Ty組大鼠腎組織染色圖。

2.3各組大鼠NF-κB、TGF-β1 mRNA水平比較 Wt、Tz組及Ty組大鼠腎組織中NF-κB mRNA水平分別為(1.27±0.14)、(8.04±2.16)、(5.68±1.09)；TGF-β1 mRNA水平分別為(1.09±0.11)、(8.23±1.37)、(4.41±0.64)。Tz組及Ty組NF-κB、TGF-β1 mRNA水平高于Wt組，Ty組NF-κB、TGF-β1 mRNA水平低于Tz組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.43組TGF-β1陽性表達情況比較 免疫組化檢測結果顯示，Wt組TGF-β1陽性表達最低，Tz組TGF-β1陽性表達最高，且Ty組TGF-β1陽性表達較Tz組明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為Wt組大鼠腎組織TGF-β1陽性表達；B為Tz組大鼠腎組織TGF-β1陽性表達；C為Ty組大鼠腎組織TGF-β1陽性表達。

2.5Western blot法檢測NF-κB、TGF-β1蛋白變化 Wt組、Tz組及Ty組大鼠腎組織中NF-κB蛋白表達水平分別為(0.16±0.02)、(0.72±0.09)、(0.45±0.05),TGF-β1 蛋白表達水平分別為(0.24±0.02)、(0.81±0.11)、(0.36±0.04)。Ty組及Tz組NF-κB、TGF-β1蛋白表達水平高于Wt組；Ty組NF-κB、TGF-β1蛋白表達水平低于Tz組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 Western blot檢測NF-κB、TGF-β1蛋白表達水平

3 討 論

DN是全球糖尿病患者中發病率較高的微血管疾病，在我國DN的發病率逐年升高[9]。有研究表明，DN臨床表現腎臟肥大、腎小球濾過率增高、腎小球內膜增厚，病情加重，研究表明，尿蛋白與DN發展有密切關系[10]。當人體血液中糖分升高時，體內糖代謝出現紊亂，會促進多元醇活化，激活蛋白酶通路會增加晚期糖基化的產生，使病情迅速發展，血液黏度增加，血管內皮組織活化，炎性因子增加，打破機體平衡，誘發微血管疾病的發生，最終發展為DN[11-12]。DN發展為終末期腎臟病后，治療難度增加，治療效果下降，因此，及時防治DN對腎組織的保護意義重大[13]。

通過觀察大鼠24 h尿蛋白定量，Tz組大鼠較Wt組有明顯上升，Ty組大鼠低于Tz組，但高于Wt組，GSK-3β抑制劑可降低大鼠尿蛋白水平。有研究表明，抑制GSK-3β活性，可降低DN大鼠血清纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)及蛋白尿水平，改善腎臟凝血纖溶狀態，對腎臟起到保護作用。通過觀察大鼠腎組織HE染色，NF-κB、TGF-β1表達發現，Wt組大鼠腎組織內細胞結構、形態較完整，未觀察到增生、肥大的細胞，Tz組大鼠腎小球、系膜基質生長異常，毛細血管管腔、腎小管管腔凹陷、阻塞，伴有水腫間質；Ty組大鼠腎小球和腎小管病變程度較Tz組有明顯好轉；與Wt組比較，Tz組NF-κB、TGF-β1表達水平明顯升高，與Tz組比較，Ty組NF-κB、TGF-β1表達水平低于Tz組，較Wt組有所升高。說明注射GSK-3β抑制劑后TGF-β1明顯降低。有研究證實，持續高血糖和胰島素抵抗可導致活性氧及糖基化終末產物增加，進而啟動炎性反應、內皮功能障礙激活NF-κB信號通路，高糖作用下NF-κB活性增強，導致TGF-β1趨化因子和細胞黏附分子等細胞因子釋放增加[14]。過量的TGF-β1、IL-6及MCP-1可導致內皮細胞凋亡，炎癥水平升高，NF-κB可影響血管內皮生長因子等多種信號通路的表達，導致血管細胞損傷及血管生成，促進DN的發生[15]。有研究證實，在患者體內NF-κB、TGF-β1表達水平呈上升趨勢，會使DN患者病情加重，同時NF-κB是檢測疾病發生的重要指標之一，在臟器損傷中扮演重要角色，在炎癥或腎臟損傷后，NF-κB水平上升迅速[16]。TGF-β1屬于一組新近發現的調節細胞生長和分化的TGF-β超家族，在細胞增殖、細胞分化過程中起調節作用，促進細胞外矩陣合成，在多種疾病中呈過表達趨勢[17-18]。TGF-β1/2可作為DN的預后指標使用，TGF-β1負調節可以對腎組織關聯成纖維細胞的分化產生抑制作用，并且可以阻礙疾病微環境的形成減緩病情[19]。有研究證實，DN患者受到TGF-β1過表達影響疾病呈惡化狀態，免疫功能也會受到抑制，腎損傷程度明顯加重[20-21]。TGF-β與其他因子共同激活了NF-κB，導致巨噬細胞聚集向M1極化促炎性反應，GSK-3β是一種存在于真核細胞中、維持上皮細胞結構和表型所必需的多功能蛋白激酶，具有調控該酶催化糖酵解、參與胰島素、調控炎性反應等功能[22]。抑制GSK-3β活性可改善胰島素抵抗，抑制高糖介導的系膜細胞凋亡。有研究表明，抑制GSK-3β可調控RANK-RANKL的表達與活性，從而下調了NF-κB的表達，減輕炎性反應，緩解DN病變進程[23]，這與本研究結果相似。

綜上所述，GSK-3β抑制劑能減緩糖尿病大鼠腎損傷程度，降低腎組織中NF-κB和TGF-β1的表達。