丹皮酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及對TLR4、IL-23及SOD活性的影響*

丁華勝，王永劍

南方醫科大學深圳醫院急診科，廣東深圳 518101

心肌缺血再灌注損傷是臨床上最常見的病理生理過程之一，近年來有研究表明，在急性心肌缺血再灌注損傷時血漿中脂質過氧化物增多,而心肌中的超氧化物歧化酶(SOD)因合成減少、被灌注液沖洗及消耗增加而減少,當補充外源性的SOD時則減輕氧自由基的損傷,從而降低致死性心律失常[1-2]。白細胞介素(IL)-23是一種促炎細胞因子，作為IL-12家族成員，其廣泛參與心肌梗死、銀屑病、腫瘤等多種疾病過程并發揮著重要作用[3-4]。Toll樣受體4(TLR4)是天然免疫系統識別病原微生物的主要受體，有研究表明 TLR4與IL-23參與了心肌缺血再灌注損傷中的致病過程[5-7]。丹皮酚具有神經保護、抗過敏、抗腫瘤、抵抗脂質過氧化、鎮痛消炎等效能,對于心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌組織，丹皮酚具備一定的保護性功能[8-11]。本研究探討丹皮酚對心肌缺血再灌注損傷保護中TLR4、IL-23及SOD的影響，分析其對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 動物清潔級成年SD雄性大鼠 52 只，體質量 230～300 g，全部購自武漢大學實驗動物中心。

1.2分組和給藥 把實驗大鼠隨機分成假手術組、模型組、丹皮酚低劑量組(15 mg/kg)、丹皮酚高劑量組(30 mg/kg)，每組13只SD大鼠。其中丹皮酚高、低劑量組在術前10 d均采用丹皮酚灌胃給藥的方法建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，每天給藥1次。以上4組大鼠成功造模3 h后立即處死，采集、收集各組血液與心臟標本后進行相關指標檢測。

1.3儀器與試劑 TLR4 兔多克隆抗體、IL-23兔多克隆抗體由英國 abcam 公司提供;水合氯醛為山東魯南制藥廠產品；99%純度的丹皮酚，為Sigma公司產品，由0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)制備；2,3,5-氯化三苯基四氮唑試劑由浙江省華東醫藥股份公司提供。

1.4大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立 將戊巴比妥鈉(用量為30 mg/kg)注入大鼠腹腔內，進行麻醉處理，大鼠呈仰位固定，待完成氣管插管并與人工呼吸機連接后，從胸骨左側 3 mm 第4肋間處進行開胸操作，分離心包，暴露心臟，接著用4-0絲線穿過左心耳下緣冠脈前降支起始部約3 mm 處，在結扎線下置入乳膠管直徑0.15 cm，之后收緊結扎線后打結，阻斷45 min后，將結扎線松開，然后進行3 h再灌注[11]。通過大鼠心電圖結果來判斷大鼠心肌缺血再灌注損傷模型是否建立成功，如果發現ST-T抬高，待放開絲線，ST-T又有所降低則大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立成功。

1.5檢測方法

1.5.1心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死面積測定 再灌注3 h后立刻對冠狀動脈進行結扎處理，并在頸動脈部位注入伊文斯藍 1.5 mL，隨后將心臟取下用磷酸鹽緩沖液進行沖洗，將脂肪、心房、血管等無關組織丟棄，用濾紙把左心室水分去除后放置在冰箱-20 ℃內進行冷凍處理。然后將心尖處朝上，對心臟進行切片處理，共切5片，厚度一致，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑試劑染色法測定心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死面積，無藍染為危險區,灰白色為梗死區，由此計算出心肌梗死面積占危險區心肌面積百分比。

1.5.2血清SOD活性測定 有效再灌注3 h后，在腹主動脈位置采集血液標本，然后實施以2 500 r/min 15 min離心處理，將獲得的血清移至EP管內，置于冰箱-20 ℃內待檢。借助分光光度計，通過比色法分別在440 nm、660 nm下對吸光度(A)值進行檢測，同時對SOD活性進行測定，嚴格遵循試劑盒說明書操作。

1.5.3TLR4陽性細胞平均積分光密度(AIOD)測定 通過隨機方式，在各組中選擇5 只SD大鼠，采用免疫組化檢測TLR4，若借助光鏡，觀察心肌細胞胞漿見均質顆粒，其顯示為棕黃色，則判定為陽性細胞。借助顯微圖像采集系統，對各張免疫組化切片，通過隨機方式確定出5個高倍視野(×400)，再通過專業圖像分析軟件Image ProPlus 5.0計算TLR4陽性細胞AIOD。

1.5.4大鼠心肌組織IL-23 蛋白水平檢測 采用蛋白質免疫印跡法，對大鼠心肌組織IL-23蛋白水平進行測定。對實驗動物進行3 h再灌注處理后，采集處于結扎線水平以下的左心室心肌組織，然后參照相對分子質量配制12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉膜,用5%的脫脂奶粉封閉,4 ℃孵育一抗過夜,用IL-23蛋白對應的辣根過氧化物酶標記的二抗孵育后,采用電化學發光法顯色，以β-actin為內參計算上述各組IL-23蛋白水平。

2 結 果

2.1丹皮酚對心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響 丹皮酚低劑量組梗死面積占危險區心肌面積百分比為(31.23±2.81)%、丹皮酚高劑量組梗死面積占危險區心肌面積百分比為(27.92±2.53)%，與模型組梗死面積占危險區心肌面積百分比[(36.48±3.76)%]比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2各組大鼠心肌組織IL-23蛋白、TLR4陽性細胞AIOD、SOD活性比較 模型組、丹皮酚低劑量組、丹皮酚高劑量組大鼠心肌組織IL-23蛋白水平、TLR4陽性細胞AIOD、SOD活性與假手術組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；丹皮酚低劑量組、丹皮酚高劑量組大鼠心肌組織IL-23蛋白、TLR4陽性細胞AIOD、SOD活性與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心肌組織IL-23蛋白、TLR4陽性細胞AIOD及SOD活性比較

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的機制復雜，在其病發過程中，氧自由基(OFR)、鈣超載、炎性反應等均有所參與，在炎性反應發生的同時，數量可觀的OFR及細胞因子產生，從而提高血管通透性以及引發水腫。藥物預處理的實施，可促進血、氧供應不足下心臟耐受力的增強，使得由心肌缺血再灌注損傷造成的心肌損傷受到更為有效的保護[12-13]。本研究中通過丹皮酚預處理保護心肌缺血再灌注損傷功能進行觀察，發現在丹皮酚作用下，減少TLR4陽性細胞AIOD及前炎性細胞因子IL-23的釋放、SOD的合成增加使得減輕了氧自由基的釋放，降低了心肌梗死的面積，實現對心肌缺血再灌注損傷的保護。

SOD作為機體內主要的抗氧化酶及超氧自由基清除劑，此物質活性反映出在清除自由基方面組織所具備能力。本研究顯示，與假手術組比較，模型組SOD活性明顯減少，這是因為缺血再灌注中心肌中的SOD合成減少、消耗增加、甚至部分被灌注液沖洗,說明本研究制作的心肌缺血再灌注模型成功。另外，與模型組比較，發現丹皮酚低劑量組、丹皮酚高劑量組SOD活性均明顯升高，說明高、低劑量丹皮酚能夠增強缺血再灌注心肌中的SOD活性、減輕自由基的損傷，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。

Toll樣受體在巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等免疫細胞中大量存在，為各種病原微生物的識別受體啟動宿主防衛反應。TLR4是人類與免疫炎癥密切相關的信號轉導受體蛋白[6,14]。IL-23屬于一類促炎細胞因子,其大多產生自巨噬細胞及激活態樹突狀細胞，其受體大量分布在自然殺傷細胞、巨噬細胞、T細胞和樹突狀細胞等細胞表面,目前有研究證實，IL-23經由TLR4對心肌缺血再灌注損傷施以調控作用[15-17]。本研究結果表明丹皮酚能夠明顯降低模型組的心肌缺血TLR4陽性細胞的表達，防止缺血再灌注損傷進一步惡化。另外，丹皮酚能夠使IL-23蛋白水平下調及SOD活性顯著升高，對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用，此保護效應在丹皮酚高劑量組優勢更顯著。

綜上所述，丹皮酚可使大鼠心肌缺血再灌注損傷的心肌組織內TLR4、IL-23蛋白水平下調，增加SOD活性，縮小大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌梗死面積，可在一定程度上有效保護心肌缺血再灌注損傷。