基于HS-SPME-GC-MS對云南地區雷公藤有毒蜜的分析

趙琴 莫湘桂 譚墾

（1 中國科學院西雙版納熱帶植物園；2 中國科學院大學）

當蜜源植物花期結束或者氣候干旱導致植物蜜露分泌下降，蜜蜂會采集有毒蜜源植物花蜜或蜜露，生成含有植物源毒素的蜂蜜[1-3]。云南地區生物多樣性豐富，植被覆蓋率高，蜂群可以采集的蜜粉源植物種類豐富。根據文獻記載，云南地區有毒蜜粉源植物主要有毛茛科、罌粟科、山茶科、瑞香科、衛矛科、藍果樹科、杜鵑花科、馬錢科、茄科、馬?？啤⑹饪坪途湛频戎参颷4]。迄今，僅少數文獻對我國有毒蜜源植物種類、分布、花、花期及毒性等進行系統整理歸納[4,5]，為蜜蜂放養場地選擇及采取適宜預防措施提供指導，并為蜂蜜食用安全及中毒原因追溯提供科學參考。盡管蜂農對有毒蜜花期的了解可以規避掉部分有毒蜜的產生，但更多情況下蜂農主要關注蜂群放置地點的主要蜜源，所以造成每年都會有有毒蜜流入市場，對消費者的身體安全造成威脅。近些年，由于人們盲目追求野生蜂蜜，食用未經過安全檢測的蜂蜜，尤其在有毒蜜源山區，誤食有毒蜂蜜而中毒的事件時有發生，對有毒蜜的研究已經成為關系蜂蜜市場安全的一個重要研究內容。

國內對于有毒蜜研究的相關文獻主要集中在有毒蜜源植物的種類、分布以及有毒植物的花粉鑒別[4-9]，也有部分國內外學者對有毒蜜源植物的生物堿進行了一定研究。國外關于有毒蜜的研究也主要集中于基于液相色譜法檢測有毒蜜中不同的有毒生物堿以作為對有毒蜜的生物標記。例如，陳順安[10]采用高效液相色譜（HPLC）方法，對昆明山海棠蜜的檢測發現昆明山海棠蜜中存在雷公藤甲素；趙玲玲[11]采用超高效液相色譜-質譜聯用（UHPLC-MS/MS）的方法，對博落回蜂蜜中的異喹啉類生物堿的定性和定量分析，測得博落回蜂蜜中主要存在4種異喹啉生物堿。

然而，上述方法所采用的液相色譜法雖然都能對有毒蜜進行確定，但實驗的前處理過于復雜，過程繁瑣，耗時長，使得其效率不能滿足快速經濟的檢測需求。因此，本研究選擇采用固相微萃取氣相色譜質譜聯用的方法HS-SPME-GC-MS，希望可以實現對有毒蜜的快速鑒定，為蜂蜜市場的安全檢測提供技術支持。

1 儀器與試劑

1.1 實驗儀器

7890A-5975C氣象色譜質譜聯用，美國Agilent公司；HP-INNOWAX（60m×0.25mm×0.25μm df）色譜柱，美國Agilent 公司；65μmPDMS/DVB萃取頭，美國Supelco公司；LE303E/02電子天平，德國Mettler Toledo公司；Milli-Q Integral 15超純水儀，德國Merck Millipore DE公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒公司；Vortex3000振蕩器，德國Wiggens公司；15ml頂空萃取瓶，安徽賽普瑞斯玻璃機械有限公司。

1.2 樣品及試劑信息

蜂蜜樣本全部取自云南地區，包括石榴蜜、枇杷蜜、苕子蜜、棗花蜜、油菜蜜、咖啡蜜、疑似雷公藤的有毒蜜（姚安縣、哀牢山保護區）等，且于該花花期在當地養蜂場直接采集，并將采集的樣品在8℃下避光保存。

對甲酚，分析標品，上海化成工業發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

頂空直接進樣法：準確稱取2.5g蜂蜜，按照5:1的比例加入0.5ml超純水放置于15ml頂空瓶中，然后用PTFE/硅膠隔膜緊緊地蓋住瓶口，旋緊瓶蓋密封待測。樣品提取前在60℃加熱10min，用混勻器混勻。

頂空固相微萃取法：將65μmPDMS/DVB萃取頭在250℃條件下老化半小時。將經老化處理后的萃取頭插入裝有2.5g蜂蜜的頂空瓶，快速推出萃取纖維頭，置于60℃水浴中恒溫60min，使纖維頭充分吸附蜂蜜的揮發性成分，進樣時，在250℃條件下解吸，同時啟動數據采集，2min后拔出萃取頭。

1.3.2 實驗條件

圖1 對甲酚標品及8種蜂蜜中對甲酚色譜圖

表1 哀牢山和姚安的7種有毒蜜揮發性成分匯總

固相微萃取條件：萃取溫度60℃，萃取時間60min；拔針時間2min；操作模式：恒定。色譜條件：進樣口溫度：250℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持2min，升溫速率5℃/min至220℃，升溫速率10℃/min 至250℃，保持11min；分流進樣，載氣：氦氣（99.99%），恒流流速1.0ml/min，分流比5:1。質譜條件：電離方式電子轟擊電離（EI+）；電子能量：70eV；離子源溫度230℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式：全掃模式，掃描范圍35～550m/z；溶劑延遲0min。

1.3.3 定性與定量分析

采用質譜數據庫（NIST 08譜庫）對揮發及半揮發性成分進行定性分析，并結合標準品進行定性和半定量分析。

2 雷公藤有毒蜜的GC-MS分析

本研究按照1.3.2的條件對哀牢山和大姚的7種有毒蜜樣品中的揮發性成分進行分析，通過對NIST8.0圖譜庫檢索、圖譜解析，最終在2個哀牢山和5個姚安樣品中解析出133個成分。通過對雷公藤有毒蜂蜜化學指紋圖譜疊加圖比對研究得知這7種有毒蜂蜜的共有成分為異戊醇、2-庚醇、壬醛、順-A,A-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇、反-A,A-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇、冰醋酸、2-乙基己醇、苯甲醛、異佛爾酮、優葛縷酮、己酸、苯乙醇、辛酸、對甲酚、壬酸、正癸酸、棕櫚酸這17種成分。

在表1中將有毒蜜中的揮發物種類歸為醇、醛、酚、烷烴、酸、酯、醚、酮以及其他成分9類。結合相對面積可以得到在姚安采集的有毒蜜：姚安1、姚安2、姚安3中含量較多的揮發性成分是酸類、酯類和酮類；姚安4和姚安5中醇類、酸類、酯類和酮類的含量比較多；在哀牢山1和哀牢山2中醇類、酸類和酮類的含量比較多。根據統計結果得知，在有毒蜜中醇類、酸類、酯類、酮類的化合物種類比較豐富。

通過對雷公藤有毒蜜中揮發性成分的分析發現，在所檢測的7種有毒蜜中都存在對甲酚，對甲酚是一種高毒物質，口服-大鼠LD50為207mg/kg。對化合物進行定性確認，分析結果顯示：對甲酚標品保留時間為34.147min，定性離子107/77；在有毒蜜中的保留時間約為34.14min，在該出峰位置均發現定性離子（107/77），說明雷公藤有毒蜜中均存在化合物對甲酚。結合對云南地區石榴蜜、枇杷蜜、苕子蜜、棗花蜜、油菜蜜、咖啡蜜7種常見蜜源的對比分析發現，這種化合物僅在棗花蜜中出現過且相對含量比較少。實驗中通過對甲酚標品對有毒蜜及棗花蜜中的對甲酚色譜圖疊加，得到了圖1。通過峰面積和濃度比值得到這8種蜂蜜中對甲酚的含量，其中有毒蜜中對甲酚的含量在0.005mg/kg～0.11mg/kg，棗花蜜中對甲酚的含量相對較少為0.02mg/kg，根據此檢測結果可以將對甲酚作為鑒別有毒蜜的一個依據。此外，經過研究發現在有毒蜜中含有多種有毒成分，其中在哀牢山有毒蜜中檢測到異喹啉也屬于高毒物質，口服-大鼠LD50為331mg/kg。雖然目前檢測結果顯示這些成分含量都不是很高，但是如果經常性的食用含有此類物質的有毒蜜同樣會對健康造成危害。

3 結果與討論

本研究發現哀牢山和姚安有毒蜜中的揮發性成分存在較大差異，很可能是因為這些蜂蜜是中華蜜蜂采集自不同花型造成，在雷公藤植物周圍存在一些其他花，不同采集地點周圍分布的植物存在差異造成這些蜂蜜在揮發性成分上的差異。但是研究結果表明這7種有毒蜜中都存在較高含量的對甲酚，而且與云南地區7種常見單花蜜對比，僅棗花蜜中存在該成分，并且低于有毒蜜，所以認為對甲酚可以作為有毒蜜的一個標志性化合物。