淺談血凝和血凝抑制試驗操作要點

王寧

（遼寧省建平縣動物疫病預防控制中心 122400）

血凝試驗 （HA） 是根據禽流感病毒的血凝素能與雞紅細胞發生凝集現象的特點而建立，而這種紅細胞凝集現象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗 （HI）。

1 操作要點

1.1 血清處理與保存

采血樣一般以靜脈血為主，采集后要及時分離血清，保證血清清透無溶血。血清樣品要盡早檢測或置4℃冰箱保存5d，超過一周需置—20℃冷凍保存，切忌反復凍融[1]。

1.2 稀釋液配制

HA-HI 試驗緩沖液為 0.01mol/L，pH＝7.2 的 PBS，PBS 盡量現用現配，高壓滅菌后使用，一經使用保存期不要超過3周。pH 要在高壓后調節，若在高壓前調到7.2，高壓后會有所改變。

1.3 1%紅細胞懸液制備

1%紅細胞懸液要現用現配，采血雞要求至少3 只SPF 成年公雞。

洗滌雞紅細胞離心轉速為1000～2000rpm，離心10min （檢測禽流感抗體時1000rpm，檢測雞新城疫抗體時2000rpm）。

洗脫好的紅細胞原液4℃保存備用，配制紅細胞懸液時應吸取試管底部的紅細胞進行稀釋，若吸取上層紅細胞可能會導致懸液濃度偏低。使用前一定要搖勻，防止紅細胞下沉，保證每一孔中加入的濃度準確一致。

1.4 試劑的使用與保存

凍干的病毒抗原應按照說明書要求溶解并保存，可以無菌操作將其分裝成小包裝，以避免反復凍融，并有效減少細菌污染。

1.5 HA 試驗

HA 試驗測定抗原效價，做 3 個重復即可。室溫 （20～25℃） 靜置 40min 后觀察結果。判定時，可將反應板傾斜[2]，觀察紅細胞有無淚滴狀流淌。能使紅細胞完全凝集的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1 個血凝單位 （HAU）。注意：對照孔應呈現完全不凝集，否則試驗不成立。

HA 試驗是對抗原效價的一個初步判定，最終要經過4HAU 抗原回滴對抗原進行最終校正。根據HA 試驗結果配制4 個血凝單位 （4HAU） 的病毒抗原。例如血凝的終點滴度為1：256，則 4HAU 抗原的稀釋倍數應是 1：64。

4HAU 抗原回滴同樣做 3 個重復，稀釋至第 4 列，第 5 列為紅細胞對照。

若HA 效價判定準確，4HAU 抗原回滴時第1、2 孔發生凝集，第 3、4 孔流淌。

若HA 效價判定不準確，4HAU 抗原回滴出現以下兩種情況。

（1） HA 效價判高，4HAU 抗原濃度會偏低，第 2 孔流淌，需添加抗原；

（2） HA 效價判低，4HAU 抗原濃度會偏高，第 3 孔發生凝集，需補加PBS。

1.6 HI 試驗

HI 試驗應同時設立陰、陽性對照，添加抗原后須室溫靜置30min 后再添加1%紅細胞懸液。注意：滴加抗原和紅細胞時要從后往前加，即從低濃度向高濃度加，滴頭要懸空，不要接觸到孔里的液體；加紅細胞時要經常晃動混勻，防止紅細胞下沉[3]。

結果判讀以完全抑制4 個HAU 抗原的血清最高稀釋倍數作為HI 滴度。滴度是指產生完全不凝集 （紅細胞完全流淌) 的最高稀釋度。

判定時需要與紅細胞對照孔進行對照，與紅細胞對照孔紅細胞流淌速度一致，淚滴大小一致的稀釋倍數最大孔為檢測樣品的最終效價。

2 結果判定

病毒對照孔：完全凝集

RBC 對照孔：無凝集

只有陰性對照孔血清滴度不大于2log2，陽性對照孔血清誤差不超過1 個滴度的試驗結果才有效。

測定孔：RBC 沉于孔底中心，呈紐扣狀，將板傾斜呈淚滴狀流淌。

血凝抑制試驗效價：呈完全血凝抑制的最高血清稀釋度。禽流感HI 價小于或等于3log2 判定試驗陰性，HI 價等于4log2 為可疑，需重復實驗，HI 價大于或等于5log2 為陽性。

3 反應條件

3.1 溫度

試驗要求室溫 (20～25℃) 下操作，若環境溫度難以控制，可將反應板置于室溫溫箱內。

3.2 時間

孵育時間要掌握好，不論HA 還是HI 試驗，加入紅細胞后孵育時間均為40min。但在一些病毒株中可見紅細胞從病毒中解脫，若有此情況發生，可提前判定 （25～30min） 或 4℃下孵育。總之，紅細胞對照完全凝集時即可進行判讀。

4 小結

為了試驗的準確性，移液器要選擇合適的量程；加樣、稀釋時要注意力集中，避免漏加、復加；血清在稀釋前要充分混勻；加抗原和紅細胞時滴頭要懸空，從后往前加，以免交叉污染；嚴格控制溫度和時間；必須要進行4HAU 抗原回滴，以避免最終結果出現偏差。總之，只有認真對待每一步的操作，才能有效降低誤差，得到較為準確的試驗結果。