RT-PCR技術檢測豬瘟病毒應用淺析

陳隆全

（重慶市綦江區東溪鎮畜牧獸醫站 401434）

豬瘟是由豬瘟病毒引發的接觸性傳染病，病死率高，傳染速度快，一旦大范圍傳播，必然給養殖戶造成巨大經濟損失，威脅我國養殖行業的發展。由于豬瘟病毒臨床表現朝向非典型發展，在臨床診斷病豬時受到多種因素感染，很難快速準確地提供診斷結果，延誤早期隔離，增加了豬瘟傳播的風險。

1 材料和方法

由重慶市動物疫病防控中心提供豬瘟病毒陽性對照材料，將病死豬扁桃體和淋巴結進行取樣備用。準備RT-PCR 試劑盒、RNA 試劑盒。

2 設計合成引物

使用RT-PCR 合成特異性引物，設計擴增片段為682bp。

3 制備樣品

對病死豬進行剖檢，在無菌環境下采集扁桃體和淋巴結，研磨后添加生理鹽水進行稀釋處理。設定5000r/s 經過5min 離心處理，取上層清液為樣品。

4 提取病毒基因組總RNA

按照試劑盒說明，取 100μL 上層清液，添加至 1.5mlEP 管中，加入 SolutionR1 100μL。混合后振蕩 30s，放在室溫環境中靜置 60s。經過處理后，添加 SolutionR2 600μL，經過充分混合顛倒后，在室溫環境下靜置3～5min。添加上層清液后套離心管，再次進行30s 離心處理。將外套管內部液體倒出，添加Wash Buffer 600μL，經過 30s 離心處理后，將接液管內部液體倒出，要進行兩次洗滌處理。將空柱放在10000r/min 離心處理，1min 后轉移至新離心管中。在新離心管中轉入Spin column，膜中央添加 20～50μL Elution Buffer，在室溫環境中靜置60s，經過 30s 離心處理后，可以得到 RNA，可以在-70℃下保存或者直接擴增處理。

5 擴增處理

將總 RNA 為模板擴增，取 0.4μL 上下游引物，設定 45℃，經過 30min 反轉錄后，升高至 94℃進行 5min 預變。在 94℃下經過 30s 變性，設定 52℃進行 45s 退火。在 72℃下進行 45s 的延伸，重復35 個循環。在72℃下進行10min 延伸。

6 熒光定量擴增

以總 RNA 為模板擴增，取 0.4μL 上下游引物，0.4μL 探針 ，0.4μL Passive Reference Dye，1μLRNA 模 板 。并 使 用RNase-free Water，添加至 20μL。設定擴增程序，設定 45℃，經過 25min 反轉錄后，升高至 95℃進行 2min 預變[1]。在 95℃下經過 10s 變性，設定 55℃進行 30s 退火。在 72℃下進行 30s的延伸，重復 5 個循環。在 95℃下進行 10s 變性，在 55℃下進行30s 退火，經過40 個循環，結束后對熒光進行收集。

7 檢測結果

7.1 判定標準

檢測Ct 值不超過35，擴增曲線表現出明顯指數增長期，可以判斷樣本為陽性。若Ct 值處于35～40 之間，需要進行重復檢驗，Ct 值仍然處于這一范圍，擴增曲線出現指數增長期，可以判斷為陽性，否則樣本為陰性。若沒有檢測到Ct 值，或者樣本Ct 值超過了40，可以判斷樣本為陰性。

7.2 擴增結果

提取樣本總RNA 進行RT-PCR 擴增處理，使用1%瓊脂糖凝膠對產物電泳，對照陽性片段。在682bp 附近，樣品有帶則可以確定樣本為豬瘟病毒陽性。

7.3 熒光定量擴增結果

應用熒光定量RT-PCR 方法檢測豬瘟病毒，檢測結果為陽性。和RT-PCR 一致，代表病豬已感染豬瘟病毒。

8 討論

早期診斷對控制豬瘟的擴散十分關鍵，需要根據病豬發病情況，及早采取先進技術，診斷豬瘟，才能有效控制豬瘟，避免豬瘟蔓延。PCR 技術得到深入研究，逐漸在動物疫病檢測中得到廣泛應用，同時可以取代傳統血清學和病原分離鑒定方法[2]。檢測試驗通過借鑒成熟檢測技術，在獸醫診斷中得到廣泛應用，有效減少檢測時間，讓檢測結果特異性和精準性得到顯著提高，降低豬瘟給養殖行業造成的經濟損失。RT-PCR 技術的應用顯著提高了檢測效率，規避樣本污染及假陽性結果的問題。借助于熒光定量PCT 檢測的高特異性和高靈敏性，讓豬瘟病原體檢測快捷準確。

9 結語

綜上所述，使用RT-PCR 檢測技術檢測豬瘟病毒，可快速靈敏的完成豬瘟檢測，指導病豬臨床診斷，提高診斷效率。快速獲得診斷結果后，能將豬瘟病豬快速隔離，采取科學合理的防治手段，避免豬瘟病毒的傳播，減少養殖戶經濟損失。