北海道黃楊組織培養及快繁技術研究

馬少梅

摘要 ? ?本文以北海道黃楊莖段為材料，探討了不同消毒時間、不同激素濃度配比對北海道黃楊再生體系建立的影響。結果表明，北海道黃楊莖段外植體最佳消毒時間為0.1%升汞處理8 min，最佳誘導培養基為MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

關鍵詞 ? ?北海道黃楊;外植體;莖段;組織培養

中圖分類號 ? ?S792.11 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）22-0109-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?This paper used the stems of Euonymus japonicu as the materials， explored the effects of different disinfection times and hormone concentration on the establishment of regeneration system. The results showed that the best disinfection effect of the explants of Euonymus japonicus was achieved by 0.1% HgCl2 for 8 minutes，and the optimal induction medium was MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L.

Keywords ? ?Euonymus japonica; explant; stem; tissue culture

北海道黃楊（Euonymus japonicus）是衛矛科衛矛屬常綠闊葉樹種，具有極強的耐寒特性，能耐-23.9 ℃低溫，是我國華北地區抗寒性最好的常綠闊葉喬木[1-2]。北海道黃楊組織培養的成功，為短時間內快繁苗木以滿足市場需求提供了技術基礎，同時也可為今后研究這一樹種的植株再生及外源基因導入，培育抗寒、抗旱新品種提供參考。探索北海道黃楊再生體系的建立，以期為今后做好遺傳轉化工作奠定基礎。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?外植體選擇

將采集的北海道黃楊枝條用自來水和軟毛刷洗刷干凈，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡10 s，再用0.1%升汞溶液振蕩消毒（設10、8、6 min等3個消毒處理），最后用無菌水沖洗5～6次，保證材料表面消毒液沖洗干凈，用消毒濾紙吸干表面水分，在無菌條件下將消毒后的外植體切成0.8～1.0 cm的小塊，接種到相應的誘導培養基上進行培養[3-4]。

1.2 ? ?培養基及配方

本次試驗以MS為基本培養基（瓊脂4 g/L、蔗糖25 g/L、pH值5.7），配好的培養基用121 ℃的蒸汽高壓滅菌鍋滅菌20～25 min，待培養基在室溫凝固后即可使用[5]。

1.3 ? ?莖段愈傷組織誘導

在基礎培養基（MS）中按照不同的配比加入不同濃度的2，4-D（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L），比較不同激素濃度對北海道黃楊莖段愈傷組織誘導的情況，從而篩選出最佳誘導培養基。

1.4 ? ?培養條件

外植體培養條件為室內溫度20～25 ℃，光照時間每天10～12 h，光照強度1 000～1 200 lx。同時，做好培養室的消毒工作，以免因外界環境消毒不徹底，增加外植體污染概率[6-7]。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?不同消毒時間對外植體滅菌成活率的影響

北海道黃楊外植體經滅菌后接種在相應的芽誘導培養基上進行誘導培養，培養2周后調查其成活率。結果表明：北海道黃楊外植體用0.1%升汞處理10 min，莖段污染率最低（5%），莖段誘導成活率為40%;外植體用0.1%升汞處理8 min，莖段污染率為10%，成活率最高（70%）;外植體用0.1%升汞處理6 min，莖段污染率為40%，成活率為30%（表1）。通過試驗對比，北海道黃楊外植體的最佳消毒時間為8 min，此時外植體污染率較少，植株成活率最高。如果消毒時間過短，植株容易受到污染;消毒時間過長，植株極易被消毒液殺死。

2.2 ? ?不同激素濃度對莖段誘導愈傷組織的影響

將經過消毒的北海道黃楊外植體切成0.8～1.0 cm長的切段，接種于莖段愈傷組織誘導培養基上進行培養。結果表明，相同濃度的6-BA和2，4-D對北海道黃楊莖段愈傷組織誘導效果不同。相同濃度6-BA對北海道黃楊外植體誘導效果不如2，4-D，相同濃度的6-BA對愈傷組織的啟動時間比2，4-D晚，相同時間誘導率也沒有2，4-D高。同時，隨著細胞分裂素6-BA和2，4-D濃度的提高，莖段愈傷組織啟動時間越早，愈傷組織的形成率也越高，但并不是激素濃度越大越有利于愈傷組織和不定芽的形成。如表2所示，2，4-D濃度越大，其誘導的愈傷組織褐化情況越嚴重，形成的愈傷組織質量越差，越不利于芽的誘導。在相同的細胞分裂素條件下，添加不同濃度的生長素，北海道黃楊外植體芽誘導情況也不同，生長素濃度越高，不定芽死亡率也越高。由此可知，MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是莖段誘導愈傷組織，進而誘導不定芽的最佳培養基。

2.3 ? ?北海道黃楊再生植株的分化培養

將已經誘導成功的不定芽接種到相應的分化培養基上進行試管苗的分化培養，相應的培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，培養20 d左右，在芽基部逐漸開始出現綠色芽點，30 d左右便有鮮嫩的植株形成，芽的分化系數約為4。

2.4 ? ?再生植株的生根及移栽

將經過復壯培養的北海道黃楊試管苗接種到相應的生根培養基進行生根培養，生根培養基為1/2MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，約20 d植株基部便有非常茁壯的不定根生成，待生根率達到70%左右、植株具有2條以上根系、根長達1 cm時，即可將組培苗轉移到干凈、通風良好的溫室內進行煉苗培養，1周后用小鑷子取出小苗，洗凈根上的瓊脂，栽植于配比為蛭石∶珍珠巖=3∶1的基質上進行培養。試管苗是否能夠移栽成功，除要求試管苗生長健壯、根系發育完整、根的維管束與莖相連之外，移栽后的養護管理也是非常關鍵的環節。試管苗移栽后的養護管理主要應注意以下幾個方面，即保持小苗的水分供需平衡、防止菌類滋生、保持一定的光溫條件、保持基質適當的通氣性、防止風雨的影響等。總而言之，就是在光、溫、水、氣、肥各方面對小苗的整體生長環境進行調控[8-9]，以保證其生長健壯。

3 ? ?結論與討論

（1）利用北海道黃楊的莖段作為外植體進行離體培養，既可以進行快速繁殖，又可以保持植株遺傳性狀的穩定性。

（2）北海道黃楊的外植體在75%乙醇消毒的基礎上，再用0.1%升汞進行8 min消毒處理，外植體污染率較低，成活率較高，是最佳的消毒處理時間。

（3）不同的培養基配比及激素濃度，對莖段不定芽的誘導率有很大的影響。激素濃度過高、過低都不利于芽的誘導及成苗，經過不同濃度梯度的自由組合篩選發現，MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是適合北海道黃楊莖段不定芽誘導的最佳培養基，不僅能保證較高的誘導率和成苗率，而且褐化程度不高，苗生長健壯。

（4）建立植物的再生體系主要是利用植物細胞的全能性，除了利用其根、莖、葉外，還可以利用花、果實、種子以及其他組織、細胞和原生質體等作為外植體建立再生體系。

4 ? ?參考文獻

[1] 陳正華.木本植物組織培養及其應用[M].北京：高等教育出版社，1980：45.

[2] 胡尚連，王丹.植物生物技術[M].成都：西南交通大學出版社，2004：54.

[3] 曹孜義，劉國民.實用組織培養教程[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，1996：78-80.

[4] 李云，梁慶豐，趙芳，等.北海道黃楊的組織培養[J].植物生理學通訊，2003，39：352.

[5] 李合生.現代植物生理學[M].北京：高等教育出版社，2006：40-45.

[6] 馬杰，郭利勇，崔波，等.金邊北海道黃楊再生體系的建立及其快繁初探[J].安徽農業科學，2008，36（6）：2245-2246.

[7] 劉曉東，周鑫.北海道黃楊樹的組織培養[J].植物生理學通訊，2003，39：236.

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