珍稀樹種流蘇樹繁殖技術的研究進展

周文玲，李際紅，曲 凱，王寶銳，國浩平，侯麗麗

（山東農業大學林學院/農業生態與環境重點實驗室，山東泰安 271018）

0 引言

流蘇樹(Chionanthus retusus)為木樨科(Oleaceae)流蘇樹屬(Chionanthus)植物，落葉灌木或小喬木，葉片革質或薄革質，長圓形或橢圓形，先端圓鈍，有時凹入或銳尖，花單性或兩性，雌雄異株[1]。流蘇樹在中國栽培歷史悠久，古老而珍稀，具有一定的觀賞、藥用和經濟價值[2]。流蘇樹高大優美，花序大而美麗，花香宜人，近年來，流蘇樹在園林庭院的綠化及美化中應用廣泛，在公園、風景區等地用作庭蔭樹、行道樹、觀賞樹種等，是人們喜愛的優良觀賞樹種[3]；其枝、花和嫩葉可泡茶，俗稱“茶葉樹”，具有一定的食用價值[4-5]；其木制上等，材質堅實，紋理細膩雅致，可以用來制作器材和細木工用[6]；果實富含油脂，可應用于工業當中；流蘇樹的樹皮、根和葉均可入藥，是公認的藥用經濟作物，特別是流蘇樹花中含有的黃酮類化合物對炎癥和神經疾病治療有著顯著治療效果，應用前景廣闊[7-8]。

此外，流蘇樹耐旱、耐寒，并具有較強的抗鹽堿能力[9-10]，對國內南北復雜的氣候環境具有較強的適應能力，并且在交通隔離帶這樣的惡劣環境也能生長良好[3]，篩選出抗逆性及特異性強的流蘇樹優良單株具有重要意義。近年來，流蘇樹在全球的分布區域逐年縮小，野生種質資源受到人為及自然的嚴重破壞趨于瀕危，在國內也面臨著嚴重的生存危機[11-16]，生產中迫切需要多樣且高效的育種方法來滿足市場多方位的需求，進一步緩解流蘇樹資源匱乏、擴大流蘇樹種群。筆者在前人研究的基礎上進一步詳細歸納總結流蘇樹繁殖技術，從而為培育優質流蘇苗木提供技術支撐。

1 種子休眠

1.1 種子休眠原因

流蘇樹種皮堅硬，對水與空氣缺乏透性、不易發芽且生長較為緩慢，有學者對流蘇種子的休眠特性進行了探究[17-22]。研究發現部分植物具有雙重休眠的特性，先發根，后發芽，如美國流蘇樹(Chionanthusvirginicus)、山 楂(Crataegus pinnatifida)、金 縷 梅(Hamamelis mollis)、銀鐘花(Halesia macgregorii)、漆樹(Toxicodendron vernicifluum)、紫杉(Taxus chinensis)、芍藥(Paeonia lactiflora)、百合(Lilium brownii)等[17]，流蘇樹同上述植物一樣，也具有這一特性。流蘇樹果實成熟落地后，在秋季先長出胚根，于第二年春天才能長出胚芽，這種胚芽和胚根呈現不同步休眠現象，稱為上胚軸休眠[18-19]。馬紅[20]在探究和討論流蘇種苗特性時發現，流蘇種皮堅硬，種子直到發芽后120天，大多種子長出三級側根后，主根長達10 cm 時仍未見胚芽或子葉出現。有學者研究發現，流蘇樹種子上胚軸休眠與胚乳組織存在抑制物質有關[21-22]。Chien 等[17]研究發現，上胚軸晚于胚根8～10周萌出的主要原因，是由胚乳組織中存在較高含量的特女貞苷、女貞甙、油酸二甲酯等水溶性苷酚類物質所引起的，并非是胚乳中存在的GA和ABA 導致其休眠。后來孟玲玲等[22]在探究與流蘇樹同科屬的美國流蘇種子休眠原因時，推測休眠的主要原因是胚乳中存在抑制物質，其次是種胚自身具有一定的休眠特性，胚具有較強的萌發潛力，并排除了由于種殼堅硬而導致種胚休眠的可能性。

1.2 打破種子休眠

從影響流蘇種子休眠和萌發的原因分析看，要促進流蘇種子的萌發，必須促進其上胚軸的活化以及解除胚存在抑制物的抑制作用。已報道的各種物理化學方法對流蘇樹種子進行處理，包括變溫催芽法、變溫層積法以及離體胚的培養等[23-24]。邱寶玲研究得出，15、20℃交替變溫處理4—6個月，可打破流蘇樹種子上胚軸的休眠，發芽率可達60%，但耗時相對較長且發芽率較低[24]。張鴿香[25]在進行流蘇種子休眠機理研究時，對山東臨沂、河南安陽、山西運城3個產地的流蘇樹種子進行變溫層積處理并測定不同時間種子的生理生化指標，發現變溫層積能有效打破流蘇樹種子的休眠，發芽率最高能達到71.7%，且在層積過程中貯藏物質逐漸分解為種子萌發提供能量來源。蔡幸鈴等[26]在流蘇果實的不同發育階段進行離體胚培養試驗，研究得出，幼胚長小于1.5 mm 時不易成苗；而當幼胚長度為7.2 mm時，發芽率相對最高，可達80%；當果實由綠轉變為紫黑色時，胚發育成熟，此時進行胚培養，發芽率降低，但仍可達60%；為促進其胚芽活化，打破上胚軸休眠，將成熟胚長出的胚根切除，其發芽率得到明顯提高。

2 播種育苗技術

目前，催根、催芽法是流蘇樹進行播種育苗的主要技術方法。盡管扦插、嫁接、組織培養等繁殖方法能夠有效地促進流蘇樹無性繁殖的發生，提高其繁殖效率，但目前很少應用在生產實踐中，種子繁殖仍然是流蘇樹進行大規模化繁殖的主要手段。

2.1 采種及沙藏

流蘇樹種子一般在9—10 月成熟，即可采種[27-28]。選擇長勢健壯、形態優美的樹作為采種母樹。挑選籽粒飽滿、健康無病蟲害的種子，清洗后用水浸法脫粒選種，再用0.1%的高錳酸鉀進行消毒處理，置于陰涼通風處陰干，忌陽光曝曬[27]。后用干凈濕沙進行貯藏，貯藏期間，每隔半個月噴水攪拌一次，噴水量至沙濕潤為止，切忌水量過大[28]。

2.2 播種與播后管理

生產中常采用催根播種與催芽播種[29-31]。催根法即將種子經過1～2個月沙藏，通過覆蓋地膜，設置草靶保濕、通風，當根長達到4～5 cm時，于當年冬季或翌年早春分批移入大田，年前種植出得快，年后種植出得慢；后又利用催芽法將種子撒播在畦中，覆土、覆沙、蓋地膜進行保溫、保濕，直至第二年5 月上旬，有3～4 片真葉長出時才進行移栽[29-30]。吳東旭在遼西流域采用室外冬季沙藏催芽處理，1月中旬經種子與濕沙按1:3混合，覆細沙、插秸稈、覆濕沙、覆土，在4 月中旬將種子取出進行堆放催芽，通過草簾保濕保熱，3～5天后有1/3種子裂口即可播種[30]。

催根法節約土地，移栽后植株生長相對旺盛，且移栽時避開農忙季節，可合理利用勞動力；而催芽法發芽率高，出苗整齊，但移栽后小苗需要經過一定的緩苗期。

3 扦插繁殖技術

扦插一般可采用嫩枝扦插和硬枝扦插。嫩枝扦插的插穗以一年生的半木質化枝條為宜，通過不同種類及不同濃度的激素處理，促使其生根率明顯提高[31-33]，硬枝扦插通常于11月下旬—翌年3月上旬進行大苗移栽[32]。

3.1 嫩枝扦插

筆者目前也在進行流蘇的嫩枝扦插試驗，4 月下旬—5 月中旬采集健壯的、無病蟲害的當年生半木質化枝條為插穗，采用100 mg/L 的IBA、20 mg/L 的復硝酚鈉、100 mg/L 的蕓苔內酯素配置混合生根處理液，同時在每千毫升溶液中加入2 g有機硅和1 g純品噁霉靈，將插穗在浸泡液中浸泡30 s，撈出側放2～10 h，晾干。混合生根處理液現用現配。采用此方法，其生根率可達到80%以上。

宋越冬[31]采用NAA 和IAA 進行嫩枝扦插試驗，結果顯示NAA 扦插生根的效果要好于IAA，采用500 mg/L NAA浸泡插條30 min，生根率相對最高，可達68.02%。時軍霞[32]研究不同濃度IBA 和NAA 對流蘇扦插生根的影響，結果表明，500 mg/L IBA 溶液浸泡插條30 min，其生根效果好于NAA 等其他處理，生根率可達87.32%。魏巍等[33]在此基礎上研究發現，采用500 mg/L 的IBA 溶液浸泡30 min，生根率相對最高，可達60.56%，這與前人對流蘇樹嫩枝扦插試驗的結果相同，研究還得出植物生長調節劑的種類是影響流蘇嫩枝扦插試驗的主要因素，因此，在流蘇樹嫩枝扦插試驗時，應首先考慮植物生長調節劑種類，其次是濃度。

3.2 硬枝扦插

白鎮海總結了一套小弓棚硬枝扦插繁殖技術，一定程度上解決了流蘇樹韌皮部比較薄、枝條脆、傳統的露地硬枝扦插成活率低的難題。硬枝扦插的關鍵在于溫床的鋪設，即通過開挖床槽、砌筑床框、鋪墊隔熱層、釀熱層、營養層以及保溫保濕層來實現對溫度及濕度的控制，促使下剪口形成層處細胞加快分裂形成愈傷組織，促進根的提早分化和形成，進而提高了硬枝扦插成活率[34]。與嫩枝扦插相比，硬枝扦插成活率較低，生產上以嫩枝扦插為主[35]。

4 流蘇嫁接繁育技術

流蘇嫁接一般在冬季或春季進行，接穗選取健康無病蟲害的健壯枝條，通常用白蠟或女貞作為砧木，較易成活[36]。于方雷[37]選擇絨毛白蠟和大葉白蠟的二根一桿苗、5 年生大苗作砧木嫁接流蘇樹，在3 月中旬和下旬進行2次嫁接，分別采用帶木質部芽接進行底接、插皮舌接進行高接，通過對比嫁接平均成活率及保存率，發現嫁接苗木明顯高于流蘇樹平茬對照苗木的生長量，并發現大葉白蠟作為流蘇的砧木較優，能夠培育成活率高、保存率好、生長快的流蘇樹苗木。

流蘇樹是嫁接桂花的良好砧木之一[38-39]。尤長偉等[38]在進行桂花嫁接技術改良時提到選擇健壯流蘇作為砧木，其耐寒性好，成活率高，通過多次嫁接對比試驗，找到了砧木與桂花的嫁接點距離地面的最適高度為40 cm。孫桂海[39]嘗試用靠接、劈接、插皮接3 種方法對紅柄木犀進行嫁接，并發現當選取流蘇花枝作為接穗時，嫁接成活后當年可以開花，以后年年開花。紅柄木犀是桂花的同胞兄弟，間接表明流蘇樹和桂花親和較好，且成活率較高。康會池[40]在進一步總結流蘇作砧嫁接桂花的優缺點時，認為流蘇作砧不僅可以縮短成齡期，提前開花，管理也相對方便簡單，不會長出多余根蘗，且造型美觀。

5 組培快繁技術

木本植物的組織培養再生途徑主要有器官發生和胚狀體發生2種方式[41]。器官發生包括外植體直接分化成器官和外植體先脫分化形成愈傷組織再分化成器官2類。胚狀體發生指外植體按照胚胎發生方式形成再生植株。流蘇樹組織培養中所用的外植體主要有胚、帶芽莖段、嫩葉及有性胚誘導出的愈傷組織4 類，筆者將從這4個方面對流蘇樹的組織培養及技術進行分析總結。

5.1 種胚快繁技術

從流蘇樹上采集種子，放入保鮮袋中帶回實驗室，室內陰干后剝去果皮和種皮，取出種胚。鑒于流蘇種子有一層堅硬的內種皮包被，種胚極少受到外界細菌的污染，所以王鑫等[42]在首次探究流蘇樹成熟種胚快繁技術時，發現對其最好的滅菌方式是為去掉果皮及內種皮后，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%升汞溶液消毒2 min，滅菌效果最好，污染率為2%。這樣既能降低污染率、褐化率，又能保證外植體的活力。而吳秀燕[43]在探究美國流蘇快繁技術中，認為種胚較種子而言較為幼嫩，容易受消毒劑侵染，并發現用75%酒精對美國流蘇去掉種殼的種子浸泡30 s后，再用0.1%升汞溶液消毒30 min，滅菌效果最好，成活率可達89.0%，污染率為7.8%。因此對外植體進行消毒處理以及消毒時間設計是必不可少的。

在進行流蘇樹成熟種胚的初代培養中，植物生長調節劑的種類和濃度對流蘇樹種胚生根率影響很大。王鑫[42]通過正交試驗篩選出最適種胚生根的培養基為WPM+0.1 mg/LNAA+3.0 mg/LGA3+2.0 mg/L6-BA，生根率達94.2%，后將生根的外植體轉接于含有1.0 mg/L GA3和1.5 mg/L 6-BA 的WPM 培養 基上，生 成 無菌苗。吳秀燕等[43]以美國流蘇成熟種胚為材料，比較了種胚在MS、B5 和WPM 3 種基本培養基的萌發率，結果表明，WPM培養基啟動效果最好，萌發率可達76%，而B5培養基僅為3%，很難萌發，后在探究不同培養基及植物生長調節劑對其萌發和植株再生的影響時，篩選出適合美國流蘇種胚萌發的適宜培養基為WPM+1.0 mg/L 6-BA，萌發率達96.3%，成苗率73.9%，平均苗高6.51 cm。

5.2 莖段快繁技術

采用流蘇莖段進行組織培養，其過程簡單，誘導出不定芽時間較短，在遺傳母本材料特性的前提下，能夠較好地保持母本的生物學性狀和經濟性狀。所以帶芽莖段是木犀科植物組織培養常用的外植體材料。王鑫等[42]在帶頂、側芽的莖段培養過程中，發現GA3對莖段起到了較為顯著的伸長作用，為后續開展流蘇樹莖段增殖及生根試驗提供了依據。吳秀燕等[43]在對美國流蘇進行快速繁殖研究時發現，細胞分裂素和生長素共同使用對莖段不定芽誘導效果較好，并且當細胞分裂素與生長素的比值為10:1時，繁殖系數為5.77，誘導率達到86.8%，此時誘導莖段不定芽效果最好，并篩選出莖段誘導不定芽最適培養基為WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

5.3 葉片愈傷組織誘導

目前還沒有關于流蘇葉片及莖段愈傷再分化出不定芽的研究報道，對葉片研究僅停留在誘導愈傷階段，且愈傷誘導率較低，不具有分化能力。吳秀燕[43]以培養60 天的美國流蘇無菌苗葉片為材料在誘導葉片愈傷組織時以WPM為基本培養基，比較單獨使用6-BA、TDZ、ZT 3 種細胞分裂素誘導流蘇愈傷組織的情況，三者比較6-BA誘導效果相對較好，但誘導率較低。后將6-BA與2,4-D組合施用，美國流蘇葉片愈傷組織的質量和胚性作用很明顯，并獲得了較高的誘導率，可達45.07%。可見葉片對不同生長調節劑的反應程度不同，其生長調節劑的組合與濃度的設計對葉片愈傷組織的誘導具有重要意義。

5.4 細胞懸浮培養

流蘇的懸浮培養主要是通過有性胚誘導出的愈傷組織在經改良后的MS 或WPM 培養基中進行懸浮培養，獲得具有增殖能力的胚性細胞，后再通過SH再生培養基等分化產生大量的體胚[45-46]。臺灣大學園藝學院羅靜琪，以幼花誘導出的愈傷組織進行細胞懸浮培養獲得體胚后，在子葉期將體胚接種于含GA 的發芽培養基中，胚根胚芽能夠順利萌發；研究還發現通過流蘇未成熟有性胚誘導出的愈傷組織在改良后的MS培養基上，在第6天開始迅速增殖，12天后生長速度開始減慢，并推斷出以14天為一繼代周期。林育正[48]以花序為外植體進行懸浮培養試驗，當胞外pH 5.7～6.1時，大大提高了體胚誘導的效率，如以含0.4 mg/L NAA的SH 再生培養基培養20 天，絕大多數細胞均可轉為原球胚期的胚性細胞，獲得胚性潛力。通過建立流蘇細胞懸浮體系，直接或間接誘導胚狀體的發生，進一步提高了流蘇的組培效率，為后面繼續開展流蘇組織培養的試驗提供了較為可靠的技術支撐。

6 展望

（1）種子繁殖方面，對流蘇種子的上胚軸休眠機理展開深入研究，明確制約流蘇種子萌發的關鍵因子及內含成分。并且根據眾多學者對流蘇種子休眠機理的研究[17-21]，采用變溫、沙藏、層積等多種方法相結合進行嘗試，從而找到打破流蘇種子上胚軸休眠的最適方法。

（2）個體無性繁殖方面，研究發現流蘇樹嫩枝扦插屬于愈傷組織生根類型。通過插條下端切口皮層部位產生愈傷組織，然后從愈傷組織上長出不定根，因此探究不同濃度的激素組合促進愈傷組織發育進而生根，從而進一步提高扦插效率。同時可嘗試在空氣、水中培養，尋找到最適生根的插境，并探索一年中適合其無性繁殖的最適階段，提高扦插效率。

（3）組織培養方面，篩選出適合流蘇樹生長的組培條件，不斷探索建立流蘇再生體系的途徑，增加其外植體種類，通過直接誘導不定芽的分化、胚性愈傷組織分化成苗等形式，提高流蘇組織培養的再生效率。此外，在建立其快繁體系時，將培養基種類、激素種類與配比、無機鹽濃度、生長環境等作為重要因素考慮。此外，還可通過誘變育種、輻射育種等對其人工誘變，篩選出更具生存能力的品種，增加流蘇資源。

（4）應用價值方面，流蘇樹長勢優良，冠型優美，觀賞價值很高，應通過平茬養干、綁縛竹竿等校直樹干，克服其干性不強的缺點[49]，注重其冠型培養，干性拔高，規模性栽植，并加強流蘇的宣傳推廣，充分發揮其綠化應用價值。

（5）古樹資源保護方面，流蘇作為古樹，栽培歷史悠久，有著重要的歷史價值與科研價值。但目前存在著諸如立地環境較差、土壤板結密實度過高、樹干腐朽中空等問題[50-51]，掌握好流蘇古樹的復壯技術，對其立地環境、不良土壤進行改善和改造，不斷提升對其保護的專業化、科學化水平，完善古樹名木保護的法制化和規范化。加大對流蘇古樹名木的宣傳力度，充分發揮古樹價值。