胎膜TRAIL表達水平及血液相關炎性標志物水平在胎膜早破發生中的作用與關系

吳兆晴 玉姣 李曉瓊 周文麗 張曙萱

[摘要] 目的 探討胎膜中腫瘤壞死因子相關凋亡配體（TRAIL）水平與血清炎性標志物水平在胎膜早破發病機制中的作用及關系。 方法 選取2019年1—12月江蘇省淮安市婦幼保健院收住的80例胎膜早破產婦為研究對象，根據破膜孕齡將其分為足月胎膜早破組（孕齡≥37周，46例）、早產胎膜早破組（孕齡28～36+6周，34例）。選取同期80名足月胎膜完整產婦作為對照組。檢測三組胎膜組織中TRAIL及血液中相關炎性標志物水平[中性粒細胞淋巴細胞比值（NLR）、血小板淋巴細胞比值（PLR）及淋巴細胞單核細胞比值（LMR）]并分析胎膜組織中TRAIL與炎性標志物水平相關性。 結果 早產胎膜早破組TRAIL陽性率，TRAIL mRNA表達水平，血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破組及對照組（均P < 0.05）;足月胎膜早破組TRAIL陽性率，TRAIL mRNA表達水平，血清NLR、PLR、LMR水平高于對照組（均P < 0.05）。胎膜組織中TRAIL表達水平與血清NLR、PLR、LMR水平呈正相關（r = 0.543、0.574、0.651，均P < 0.05）。 結論 TRAIL及血清相關炎性標志物在胎膜早破產婦胎膜中高表達，二者存在正相關。

[關鍵詞] 胎膜早破;腫瘤壞死因子相關凋亡配體;中性粒細胞淋巴細胞比值;血小板淋巴細胞比值

[中圖分類號] R714.433? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（c）-0024-04

The role and relationship between the expression level of TRAIL of fetal membranes and the level of blood-related inflammatory markers in the occurrence of premature rupture of membranes

WU Zhaoqing1? ?YANG Yujiao2? ?LI Xiaoqiong2? ?ZHOU Wenli2? ?ZHANG Shuxuan3

1.Department of Obstetrics， Xuzhou Medical University， Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province， Jiangsu Province， Huai′an? ?223002， China; 2.Department of Obstetrics， Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province， Jiangsu Province， Huai′an? ?223002， China; 3.Department of Obstetrics， Xuzhou Municipal Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou? ?221006， China

[Abstract] Objective To explore the role and relationship between the expression level of tumor necrosis factor-related apoptotic ligand （TRAIL） of membranes and serum inflammatory markers level in the pathogenesis of premature rupture of membranes. Methods From January to December 2019， 80 cases of premature rupture of membranes pregnant women admitted to Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province were selected as the research objects. They were divided into full-term premature rupture of membranes group （gestational age≥ 37 weeks， 46 cases） and preterm premature rupture of membranes group （gestational age 28-36+6 weeks， 34 cases）. 80 pregnant women of full-term fetal membranes were selected as control group in the same period. TRAIL in membranes tissue and blood related inflammatory markers （neutrophil lymphocyte ratio [NLR]， platelet lymphocyte ratio [PLR] and lymphocyte monocyte ratio [LMR]） were measured and the correlation between TRAIL and inflammatory markers in membranes tissue was analyzed. Results The TRAIL positive rate， TRAIL mRNA expression level and serum NLR， PLR， LMR levels in preterm premature rupture of membranes group were higher than those of full-term premature rupture of membranes group and control group（all P < 0.05）， and the TRAIL positive rate， TRAIL mRNA expression level and serum NLR， PLR， LMR levels in full-term premature rupture of membranes group were higher than those of control group （all P < 0.05）. TRAIL expression level in fetal membranes was positively correlated with serum NLR， PLR and LMR levels （r = 0.543， 0.574， 0.651， all P < 0.05）. Conclusion TRAIL and serum-related inflammatory markers are highly expressed in the membranes of women with premature rupture of foetal membranes， and there is a positive correlation between them.

[Key words] Premature rupture of membranes; Tumor necrosis factor-related apoptotic ligand; Neutrophil lymphocyte ratio; Platelet lymphocyte ratio

胎膜早破是圍生期常見合并癥之一，發病率為2.7%～7.0%[1]，可導致宮內感染、早產、胎盤早剝、胎兒窘迫[2]等發生，嚴重危害母兒生命健康。其發生原因及具體機制仍未完全明確，但是炎癥、細胞凋亡在這一過程中起著至關重要的作用[3-4]。腫瘤壞死因子相關凋亡配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）具有調節細胞分化、凋亡及監視免疫反應等的作用，在胎膜早破的發病中發揮了重要作用[5-6]。為此，本研究選取了江蘇省淮安市婦幼保健院（以下簡稱“我院”）產科收住的80例胎膜早破產婦，探討胎膜中TRAIL水平與血液炎性標志物水平在胎膜早破發病機制中的作用。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1-12月我院收住的80例胎膜早破產婦為研究對象，根據破膜孕齡將其分為足月胎膜早破組（孕齡 ≥37周，46例）、早產胎膜早破組（孕齡28～36+6周，34例），選取同期我院80名足月胎膜完整產婦作為對照組。對照組年齡（27.76±3.52）歲;初產婦65名，經產婦15名。足月胎膜早破組年齡（28.05±3.69）歲;初產婦38例，經產婦8例。早產胎膜早破組年齡（27.28±4.19）歲;初產婦27例，經產婦7例。三組一般資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

納入標準：①胎膜早破符合2015年中華醫學會婦產科學分會產科學組《胎膜早破的診斷與處理指南》標準[7];②胎位正常、單胎妊娠，定期產檢且產檢資料完整，對照組胎膜完整且孕齡≥37周;③對本研究知情同意。排除標準：①臨產或存在宮縮或存在胎位異常、骨盆狹窄、生殖道感染者;②經產婦有胎膜早破、子癇[8]、宮內感染、流產、死胎死產等不良妊娠史者;③存在妊娠高血壓綜合征、妊娠糖尿病、瘢痕子宮[9]、前置胎盤、妊娠合并心臟病、胎兒宮內窘迫、羊水異常等產科并發癥、合并癥者;④合并嚴重臟器功能不全、血液系統疾病、惡性腫瘤等基礎疾病者;⑤既往有吸煙、嗜酒史，妊娠期間有口服藥物史者。

1.2 方法

1.2.1 TRAIL測定? 標本采集：取產婦胎膜破口處附近大小為20×20 mm2組織，分為兩份，0.9%氯化鈉溶液沖洗后大頭針固定，一份置入凍存管投入液氮，一份置于10%甲醛溶液中固定。

TRAIL定性：取甲醛溶液固定的標本脫水，石蠟包埋，制成3 μm切片，沖洗，一抗為武漢博士德生物技術有限公司提供的兔抗人TRAIL抗體，采用免疫組化SP法[10]進行檢測。陰性對照為磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗的結果。

TRAIL mRNA定量：取置入液氮的標本，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）法[11]進行檢測：Trizol法提取組織中總RNA，反轉錄為cDNA，實時定量PCR，GAPDH為內參基因[11]。Trizol法：取1.5 mL EP管將標本置入，加入Trizol液1 mL充分勻漿、靜置，加入氯仿0.2 mL，離心（4℃、12 000 g離心15 min）;取上清液加入異丙醇0.5 mL沉淀，再次離心（4℃、12 000 g離心10 min）;棄上清液加入75%酒精1 mL洗滌、離心（4℃、12 000 g離心5 min）;棄上清液加入20 μL H2O溶解RNA。反轉錄：提取的RNA作為RNA模板，加入引物合成與RNA模板互補的cDNA單鏈，形成DNA-RNA雜化雙鏈，加入反轉錄酶水解為單鏈DNA，以單鏈DNA為模板合成另一條DNA鏈形成雙鏈DNA。引物序列：TRAIL上下游引物序列分別為5′-AGAGGCACCACTAAAAGATCGC-3′和5′-GGTTTC-ACTATGTTGGTCACTATGG-3′，擴增產物133 bp;MMP-2上下游引物序列分別為5′-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3′和5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴增產物133 bp;GAPDH上下游引物序列分別為5′-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3′和5′-AGGGATG-ATGTTCTGGAGAG-3′，擴增產物226 bp。由上海生物工程有限公司合成引物。PCR的反應條件為95℃ 10 min、95℃ 30 s、60℃ 1 h，35個循環，重復3次。

1.2.2 炎性標志物測定? 取研究對象入院時外周靜脈血3 mL，血常規檢測采用全自動血球分析儀（武漢盛世達醫療設備有限公司，型號：BC-5000），計算中性粒細胞淋巴細胞比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）、血小板淋巴細胞比值（platelet lymphocyte ratio，PLR）及淋巴細胞單核細胞比值（lymphocyte monocyte ratio，LMR）。

1.3 TRAIL陽性標準

雙盲法在顯微鏡下進行觀察，根據TRAIL陽性表達細胞百分比及顯色深淺綜合判定。陽性標準：根據陽性細胞百分比進行評分，無陽性細胞、陽性細胞 <10%、10%～50%、>50%～75%、>75%分別記為0、1、2、3、4分;根據顯色深淺評分，細胞無顯色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分;兩項評分的乘積≤3分為陰性，4分為陽性，≥5分為強陽性[12]。陽性率=（陽性+強陽性）例數/總例數×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗;胎膜組織中TRAIL水平和血清NLR、PLR、LMR水平的相關性分析采用Spearman等級相關分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組臨床資料比較

早產胎膜早破組分娩孕齡、新生兒體重、5 min Apgar評分小于足月胎膜早破組、對照組，足月胎膜早破組5 min Apgar評分小于對照組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表1。

2.2 三組胎膜組織TRAIL表達情況比較

早產胎膜早破組TRAIL陽性率、TRAIL mRNA表達水平高于足月胎膜早破組及對照組，足月胎膜早破組TRAIL陽性率、TRAIL mRNA表達水平高于對照組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表2。

2.3 三組血清炎性標志物水平比較

早產胎膜早破組血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破組及對照組，足月胎膜早破組血清NLR、PLR、LMR水平高于對照組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表3。

2.4 胎膜組織中TRAIL水平與血清NLR、PLR、LMR水平的相關性

胎膜早破產婦胎膜組織中TRAIL水平與血清NLR、PLR、LMR水平呈正相關（r = 0.543、0.574、0.651，均P < 0.05）。

3 討論

胎膜絨毛膜與羊膜之間的細胞外基質含有豐富的間質膠原纖維[13]，可適應妊娠期間不斷增大的宮腔壓力。一般而言，結構完整的胎膜是不會破裂的，但炎癥反應等多種原因導致細胞外基質膠原代謝失衡，張力不夠，宮腔壓力增大則易形成胎膜早破。研究顯示[14-16]，胎膜早破產婦破口處厚度下降35%，膠原纖維密度下降，結締組織水腫，導致胎膜應力下降、羊膜和絨毛膜分離;膠原大量降解，導致羊膜細胞脫落、基底膜退化或損傷，而期間羊膜和絨毛膜無法有效重建，炎癥細胞浸潤，導致胎膜早破。此過程中，炎癥反應、細胞凋亡起著至關重要的作用[17]。

TRAIL屬于腫瘤壞死因子家族成員，廣泛表達于宮頸、卵巢等各種細胞和組織，可作用于細胞增殖、分化、凋亡的過程，調節細胞凋亡、免疫監視等[18]。在穩定妊娠期間，TRAIL可有效維護胎膜的自我環境。研究顯示[19-20]，妊娠晚期，TRAIL可在一定程度上表達于胎盤、胎膜，尤其是羊膜腔中。本研究結果顯示，早產胎膜早破組TRAIL陽性率及TRAIL mRNA表達水平高于足月胎膜早破組及對照組（均P < 0.05）。提示胎膜早破尤其是早產胎膜早破產婦胎膜中TRAIL存在高表達，表明TRAIL與胎膜早破密切相關，其表達增高可能提示胎膜破裂的發生，甚至為胎膜早破的發病機制之一。其作用機制可能為TRAIL調控胎膜組織細胞的生長、凋亡，其表達升高，使組織活性細胞水平下降，影響細胞外基質沉積和膠原纖維合成[21-22]，從而導致胎膜結構發生變化，降低胎膜韌性、削減胎膜局部組織厚度。

炎癥反應是胎膜早破尤其是未足月胎膜早破發生的重要原因。白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子α等炎癥因子結合后可引發炎癥反應，誘導活性氧、膠原重塑[23-25]，從而影響胎膜結構，導致其破裂。本研究結果顯示，早產胎膜早破組血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破組及對照組（均P < 0.05）。胎膜早破產婦NLR、PLR、LMR水平升高，提示機體發生炎癥反應。TRAIL的升高可能與氧化應激、炎癥反應等因素有關。當供氧、供血不足時，胎盤、胎膜組織可發生氧化應激，導致異常免疫反應，激發機體產生TRAIL;生殖道感染發生時，活化中性粒細胞，導致大量炎癥因子釋放，由于TRAIL具有監視免疫介導應答的作用，因此炎癥反應發生誘發了TRAIL大量升高。本研究結果顯示，胎膜組織TRAIL表達水平與血清NLR、PLR、LMR水平呈正相關。提示炎癥反應是TRAIL升高的重要原因，NLR、PLR、LMR、TRAIL均參與胎膜早破發生。

綜上所述，TRAIL在胎膜早破尤其是早產胎膜早破產婦胎膜中高表達，與血清炎性標志物存在正相關，二者共同參與了胎膜早破發生。

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（收稿日期：2020-06-08）

[基金項目] 江蘇省婦幼健康科研項目（F201731）。

[作者簡介] 吳兆晴（1973.9-），女，副主任醫師;研究方向：母體醫學。

[通訊作者] 張曙萱（1973.12-），女，博士，主任醫師;研究方向：圍生醫學。