潛陽合劑抑制心肌成纖維細胞增殖的機制研究

陳婕 阮小芬 王肖龍

[摘要] 目的 探討潛陽合劑抑制血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導的心肌成纖維（RCF）細胞異常增殖的機制。 方法 將RCF細胞分成空白細胞組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+潛陽合劑組。Ang Ⅱ組選用經過Ang Ⅱ誘導24 h的RCF細胞異常增殖的細胞模型，Ang Ⅱ+潛陽合劑組選用經過Ang Ⅱ誘導后加入潛陽合劑干預的細胞模型。蛋白質印跡法分析并比較三組的轉化生長因子-β1（TGF-β1）、膠原蛋白Ⅰ型（Collagen Ⅰ）、Collagen Ⅲ蛋白表達，定量聚合酶鏈反應檢測并比較三組的TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ基因表達。 結果 Ang Ⅱ組TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達水平高于空白細胞組（均P < 0.01）。Ang Ⅱ+潛陽合劑組的TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達水平低于Ang Ⅱ組（P < 0.05或P < 0.01）。Ang Ⅱ組的TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ基因表達水平高于空白細胞組（均P < 0.01）。Ang Ⅱ+潛陽合劑組的TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ基因表達水平低于Ang Ⅱ組（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 潛陽合劑可以通過降低TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ基因和蛋白的表達來抑制RCF細胞增殖，改善心肌纖維化。

[關鍵詞] 潛陽合劑;血管緊張素Ⅱ;心肌成纖維細胞;心肌纖維化

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（c）-0004-05

Mechanism research of Qianyang Decoction inhibits the proliferation of cardiac fibroblasts

CHEN Jie? ?RUAN Xiaofen? ?WANG Xiaolong

Department of Cardiovascular Medicine， Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai? ?201203， China

[Abstract] Objective To discussed the mechanism of Qianyang Decoction inhibits the abnormal proliferation of cardiac fibroblasts （RCF） cells induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）. Methods The RCF cells were divided into blank cell group， Ang Ⅱ group and Ang Ⅱ+Qianyang Decoction group. In the Ang Ⅱ group， a cell model with abnormal proliferation of cardiac fibroblasts induced by Ang Ⅱ for 24 h was selected， and the Ang Ⅱ+Qianyang Decoction group was a cell model that was induced by Ang Ⅱ and intervened with Qianyang Decoction. Western blot was used to analyze and compare the transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， Collagen Ⅰ type （Collagen Ⅰ）， Collagen Ⅲ protein expression among three groups， and quantitative polymerase chain reaction was used to detect and compare the TGF-β1 and Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ genetic expression among three groups. Results The protein expression levels of TGF-β1， Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in Ang Ⅱ group were higher than those in the blank cell group （all P < 0.01）. The protein expression levels of TGF-β1 and Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ in Ang Ⅱ+Qianyang Decoction group were lower than those in the Ang Ⅱ group （P < 0.05 or P < 0.01）. The gene expressions levels of TGF-β1， Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in Ang Ⅱ group were higher than those in the blank cell group （all P < 0.01）. The gene expression levels of TGF-β1， Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in Ang Ⅱ+Qianyang Decoction group were lower than those in Ang Ⅱ group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Qianyang Decoction can inhibits the abnormal proliferation of RCF cells by reducing the gene and protein expression level of TGF-β1， Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ， hence alleviate heart muscle fibrosis.

[Key words] Qianyang Decoction; Angiotensin Ⅱ; Cardiac fibroblasts; Heart muscle fibrosis

心肌纖維化是心室重構的主要病理過程，其主要發生機制是因為細胞外基質代謝紊亂、膠原過度沉積以及各種因素導致的心肌細胞和心肌成纖維（RCF）細胞增殖[1-2]。RCF細胞廣泛存在于心臟組織中，起源于內皮，是目前公認的造成心臟細胞外基質代謝紊亂的主要細胞之一[3-6]。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS系統）在心肌纖維化演變過程中扮演主要角色。血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）是RAAS系統中的最為重要的活性效應物質，它可以通過血管緊張素Ⅱ受體1（AT1R）促進心肌細胞、RCF細胞的增殖和膠原的過度增生，從而導致心室重構[7-8]。

本課題前期研究發現，潛陽合劑可以通過降低Ang Ⅱ的水平來降低腹主動脈狹窄所致的高血壓病大鼠的血壓[9]。本研究根據前期實驗的結果，通過體外培養大鼠的RCF細胞，在細胞和基因水平研究分析潛陽合劑對轉化生長因子-β1（TGF-β1）、膠原蛋白Ⅰ型（Collagen Ⅰ）、膠原蛋白Ⅲ型（Collagen Ⅲ）的蛋白和基因的表達影響來抑制Ang Ⅱ誘導的RCF細胞增殖，為進一步探討潛陽合劑抑制心肌纖維化的機制提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 細胞

大鼠RCF細胞（上海游望生物科技有限公司，編號：C1388）。

1.2 實驗用藥

潛陽合劑：由熟地黃、鉤藤、女貞子、白蒺藜、桑葚、牡蠣、當歸、珍珠母、首烏藤9味中藥組成，由上海中醫藥大學附屬曙光醫院藥劑科提供，批號：滬藥制字Z05100449。

1.3 試劑

Collagen Ⅲ（Bioss，bs-0549R）;TGF-β1（Bioss，bs-0086R）;Collagen Ⅰ（Bioss，bs-7158R）;Candesartan（AT1R抑制劑，Harvey-bio，139481-59-7）;Ang Ⅱ（Sigma，SLBM2823V）;羊抗兔-HRP（Biovol，BV-S8008）;ECL化學發光試劑盒（CWBIO，00051403）;Trizol Reagent（Invitrogen，15596-026）;氯仿（國藥化學集團，67-66-3）;異丙醇（國藥化學集團有限公司，67-63-0）;75%無水乙醇（國藥化學集團有限公司，64-17-5）;DEPC H2O（Invitrogen，750024）;逆轉錄酶SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase（Invitrogen，R250-01）;熒光染料SYBR Green I（Invitrogen，CS7561）;Rnase Inhibitor（Fermentas，E00381）;Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen，10966034）;Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen，10966034）;100 mmol/L dNTPs（Invitrogen，1842 7013）等。

1.4 儀器

臺式高速冷凍離心機（美國Beckman，型號：Allegra 21R）;臺式高速離心機（德國SORVAL，型號：SIGMA 3-15/3K15）;Gel Doc2000成像系統;垂直電泳系統（Bio Rad）;pH計（美國Mettler Toledo，型號：320-S）;電子天平（美國AHOΜS，型號：AR5120）;恒溫水浴鍋（日本SANYO，型號：BSG-28）;雪花狀制冰機（日本SANYO，型號：SIM-F140AY65-PC）;超凈工作臺[中國蘇凈集團，型號：SW-CJ-1FD（垂直）];高速冷凍離心機（Heal Force，型號：Neofuge13R）;生物安全柜（Heal Force，型號：HFsafe 1200 A2）;熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）儀（Bio Rad，型號：CFX96）等。

1.5 方法

1.5.1 細胞培養? 大鼠RCF細胞，細胞密度4×104/mL，置于37℃，5%CO2細胞培養箱內含DMEM+10% FBS+1%雙抗培養，48 h后再更換1次培養液繼續培養，待RCF細胞生長至80%～90%后傳代進行實驗研究。

1.5.2 CCK8法摸索最佳潛陽合劑濃度? 用96孔板每孔接種4×103個RCF細胞，于第2天換無血清饑餓處理過夜后換成1% FBS維持培養。將細胞分為空白細胞組、Ang Ⅱ組（800 nmol/L）[9]、Ang Ⅱ+潛陽合劑組（10.000×10-6 mol/L）、Ang Ⅱ+潛陽合劑組（5.000×10-6 mol/L）、Ang Ⅱ+潛陽合劑組（2.500×10-6 mol/L）、Ang Ⅱ+潛陽合劑組（1.250×10-6 mol/L）、Ang Ⅱ+潛陽合劑組（0.625×10-6 mol/L）、AT1R抑制劑組，添加適量CCK8溶液，用酶聯免疫檢測儀測定其吸光度（OD490）值。根據公式計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（AAng Ⅱ-A潛陽）/AAng Ⅱ×100%，觀察潛陽合劑能拮抗Ang Ⅱ的作用的最佳濃度。

1.5.3 分組? 本研究分為3組即空白細胞組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+潛陽合劑組。

1.5.4 蛋白質印跡法（Western blot）分析檢測TGF-β1、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ蛋白表達? BCA試劑盒（碧云天生物技術有限公司，P0012A）蛋白定量后上樣，10% SDS-PAGE分離總蛋白，然后轉移至PVDF膜上，1∶500稀釋TGF-β1、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ蛋白抗體分別進行Western blot分析，使用ECL化學發光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統分析各蛋白條帶灰度值，并以Actin為內參標化各樣品蛋白電泳條帶的灰度值。

1.5.5 SYBR染料法qPCR檢測TGF-β1、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ基因? 先提取RNA樣品，質檢后調整RNA濃度，按照實驗目的稀釋RNA至統一濃度后進行RNA反轉錄程序，再將獲得的qPCR引物（見表1）與獲得的cDNA模板進行qPCR擴增，檢測細胞中目的基因的表達水平，目的基因的表達使用相對定量法。ΔCT值=樣本待測基因CT值-相應內參基因CT值;ΔΔCT值=各組ΔCT值-對照組ΔCT值;各組待測基因的相對表達倍數值=2-ΔΔCT，以該值進行統計分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 最佳潛陽合劑濃度摸索結果

1.250×10-6 mol/L潛陽合劑對細胞增殖抑制效果最好。見表2。

2.2 潛陽合劑對RCF細胞TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ基因表達的影響

2.3 潛陽合劑對RCF細胞TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達的影響

Ang Ⅱ組TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達水平高于空白細胞組（均P < 0.01）。Ang Ⅱ+潛陽合劑組的TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達水平低于Ang Ⅱ組（P < 0.05或P < 0.01）。見圖1、表4。

3 討論

心室重構是各種損傷使心臟原來存在的物質和心臟形態學發生變化。心肌纖維化是心室重構發生的關鍵，它會使心室順應性降低，舒張功能下降，使心臟電生理結構發生改變從而誘發心律失常，甚至猝死，所以改善高血壓病和各種心臟疾病引起的心肌纖維化具有重要意義[10]。在心肌纖維化過程中，主要與Ang Ⅱ激活CRF細胞中的多種因子導致大量細胞外基質的沉積有關。

TGF-β1是一類多效應的細胞因子，是維持組織內穩態的關鍵因子，是調控細胞外基質的重要監督機構[11]。有文獻報道[12]，TGF-β1是促進心肌纖維化的重要細胞因子之一，它可以使正常的成纖維細胞的表型發生轉化，改變成纖維細胞貼壁生長特性，使Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ膠原沉積。TGF-β1的表達增高是導致心肌纖維化的重要環節。并且有研究發現活化AT1R可以促進TGF-β1表達增加，并且激活TGF-β1受體，導致心肌纖維化[13-14]。同時Ang Ⅱ可以誘導Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ激活，最終加速心肌纖維化，導致心室重構。

課題組前期通過對腹主動脈縮窄致高血壓病伴左室肥厚大鼠的心肌組織進行染色后發現，模型組心肌間質的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ含量明顯增多，而培哚普利組和潛陽合劑組的膠原組織較模型組減少[15]。此次通過分析潛陽合劑對TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的基因及蛋白的表達發現，潛陽合劑可以通過下調TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ基因的表達，降低TGF-β1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白的含量，從而抑制Ang Ⅱ誘導RCF細胞的異常增殖。

綜上所述，潛陽合劑可以通過抑制Ang Ⅱ誘導RCF細胞異常增殖，改善心肌纖維化。通過閱讀文獻發現：c-Fos是TGF-β1的上游基因，c-Fos上調可引起促纖維化因子TGF-β1轉錄增加[16];miR-34a直接調控Smad4而控制TGF-β1的表達[17-18];miR-133a通過降低TGF-β1的過表達改善心臟功能[10，19];miR-663和miR-9都能抑制TGF-β1蛋白的表達和Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的水平[20-21]。并且，有研究發現心肌纖維化的發生發展與多種基因的DNA甲基化和組蛋白修飾有關[22-23]，miR-369-5p過表達可以降低DNA甲基轉移酶3A（DNMT3A）的表達來抑制RCF細胞的增殖[24];SIRT2過表達可激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）下游的LKB1基因從而抑制血管緊張素誘導的心肌纖維化[25]。所以，可以通過基因篩查進一步明確基因靶點和發生進展機制，為臨床治療高血壓病所致的心肌纖維化的藥物治療提供理論依據。

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（收稿日期：2020-03-25）

[基金項目] 國家自然科學基金青年科學基金項目（81803885）;上海市高級中西醫結合人才計劃項目[ZY（2018-2020）-RCPY-2004];上海市中醫臨床重點實驗室（14DZ2273200）。

[作者簡介] 陳婕（1990.12-），女，碩士;研究方向：中西醫結合心血管內科。

[通訊作者] 王肖龍（1965.1-），男，碩士，主任醫師，博士生導師;研究方向：中西醫結合心血管內科。