云南省勐臘縣部分豬場豬偽狂犬病病毒感染狀況調查

鐘順平 楊貴偉 劉應華 楊貴樹 高利波

摘 ?要：為了解云南省勐臘縣部分豬場豬偽狂犬病（Pseudorabies，PR）的流行情況，用PCR對2019年從該地區部分豬場采集的811份豬血液樣品進行了豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）抗原檢測。結果顯示，811份樣品中有337份檢測結果為陽性，陽性率為41.55%，不同豬場PRV陽性率介于35.4%～63.8%;哺乳仔豬、保育豬、育肥豬、種公豬和母豬的血液樣品分別為290 份、193 份、276份、10份和42份，陽性率分別為38.3%、28.6%、20%和33.3%。結果表明，PRV在云南省勐臘縣豬場中廣泛存在，不同年齡階段的豬均易感染且感染率較高，應加強對該病的防控。

關鍵詞：豬偽狂犬病病毒;PCR檢測;感染狀況;云南省

豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）屬于皰疹病毒科-皰疹病毒屬成員，是一種有囊膜的線狀雙鏈DNA病毒，也是皰疹病毒科中抵抗力較強的一種。由PRV引起的豬偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是多種哺乳動物共患的一種急性傳染病[1]。除了豬以外，其他動物感染偽狂犬病病毒后，主要表現為發熱、奇癢及腦脊髓炎，死亡率極高。豬是偽狂犬病病毒的貯存宿主，發病后臨床癥狀因感染豬年齡不同而有差異。妊娠母豬會出現流產、產死胎及木乃伊胎等綜合癥候群;初生仔豬會出現神經癥狀，如運動失調和麻痹等，最終衰竭而亡;成年豬多呈隱性感染，但可以引起呼吸道癥狀[2]。

隨著養豬業的不斷發展，云南省的豬病也越加復雜，為更好地了解和監控云南省勐臘縣PRV野毒株的感染流行情況，本研究利用PCR對2019年該地區送檢的血液樣品進行了相應的病原檢測，為后續有效控制和凈化PR及進一步研究提供基礎依據。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品

2019年云南省勐臘縣各個地區豬場送檢的811份血液樣品，包括5個規模化豬場的725份樣品和散戶的86份樣品。

1.1.2主要儀器

移液器（DRAGON公司，KA0052521）、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，SW-CJ-1FD）、高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific公司，75005440）、凝膠成像系統（天能科技有限公司，Tanon-1600）、電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-7C）、普通PCR儀（BIO-RAD公司，580BR 12007）和恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司，HWS12）。

1.1.3主要試劑

DNA提取試劑盒（百泰克生物技術有限公司），2×Transhifi Super Mix Ⅱ（含Tag DNA聚合酶，RNaase Inhibitor、dNTP和ddH2O，北京全式金公司），DNA Marker DL1000（大連寶生物公司），瓊脂糖（GENE公司）;其他試劑由云南農業大學動物傳染病實驗室提供，試劑均為分析純。

1.1.4引物設計

根據NCBI GenBank中公布的PRV基因序列（FJ797217、KJ717942和AY169694），設計一對特異性引物（表1）用于PCR檢測。引物由昆明碩擎生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1樣品DNA提取

樣品預處理和DNA提取均嚴格按照說明書進行，提取的DNA于-20 ℃下保存備用。

1.2.2 PCR擴增

將提取的DNA作為模板進行PCR擴增，反應體系為：2×Transhifi Super MixⅡ 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物 ? ? ?0.5 μL、下游引物0.5 μL和DNA 1.0 μL， ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 總的反應體系為25 μL。反應程序為： ? ? ? 94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環。取10 μL PCR擴增產物配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠孔中，120 V電壓下電泳 ? ? ? ? ? 30 min，在凝膠成像系統上觀察結果，并拍照。

2 ?結果與分析

2.1 PRV基因的PCR擴增結果

PRV基因的擴增結果同預期目的片段501 bp大小相符（圖1），表明部分樣品呈PRV陽性。在811份血液樣品中，337份樣品檢測為PRV陽性，陽性率為41.55%（337/811）。

2.2 不同豬場PRV的陽性率

在規模化豬場的725份血液樣品中，334份呈PRV陽性，陽性率為46.1%（334/725），各豬場間的陽性率差別較大，從35.4%～63.8%不等。散養戶豬群的PRV陽性率為3.5%（3/86）。見表2。

2.3 不同生長階段豬群PRV的陽性率

不同生長階段豬群（哺乳仔豬、保育豬和育肥豬）的血液樣品共759份，采集自哺乳仔豬、保育豬和育肥豬的血液樣品分別為290份、193份和776份，陽性率分別為57.9 %（168/290）、38.3% （74/193）和28.6%（79/276）。各生長階段豬群的陽性率差異較大，介于28.6%～57.9%，見表3。

2.4 不同性別豬群PRV的陽性率

公豬和母豬的血液樣品分別為10份和42份，陽性率分別為20%（2/10）和33.3%（14/42），表明種公豬和母豬均有感染，見表4。

3 ?討論

我國自1948年首次報道PR以來，已有多個地區報道了該病的流行，給無數豬場帶來了很大的經濟損失。吳美芹等在對2010-2017年21個省市的豬血清樣品進行豬偽狂犬病病毒野毒株gE抗體檢測后，發現陽性率在7.90%～45.4%[3]。中國動物疫病預防控制中心從2011-2016年的檢測數據發現gE的陽性率在13.0%～64.3%[4]。中科基因公司2017年的PRV gE抗體檢測結果顯示豬場的陽性率為77.0%，個體平均陽性率為43.3%[5]。

本文用PCR共檢測了云南省勐臘縣5個規模化豬場的725份豬血液樣品和散養戶的86份豬血液樣品，發現PRV野毒株平均陽性率為41.6%，說明PR在云南省勐臘縣的豬場中已有一定程度的流行。各豬場的PRV陽性率差別較大，豬場E的陽性率最低，為35.4%，豬場B的陽性率達63.8%，這可能與送檢血液樣品及各豬場的飼養管理和免疫程序等具體情況不同有關。據我們后續的調查發現，豬場B沒有接種過豬偽狂犬病疫苗，這應該是該豬場陽性率比其他豬場高很多的緣故。除豬場E外，4個接種過豬偽狂犬病疫苗的規模化豬場PRV陽性率平均為48.8%。結合之前的報道，發現陽性率有上升趨勢，鄭旺華等報道云南省西雙版納州兩個規模化豬場PRV抗原陽性率僅為11.9%[6]。這可能與2011年以來我國豬群中相繼出現了致病性更強的豬偽狂犬病病毒變異毒株有關，變異毒株的抗原性發生變化使現有的gE基因缺失疫苗提供的保護作用不能發揮應有的保護作用。

本次檢測散養戶豬群PRV的陽性率僅為3.5%，遠遠低于規模化豬場的陽性率（46.1%）。本次采樣的散養戶豬群均未接種過豬偽狂犬病疫苗，和之前的一些報道相比[7]，勐臘縣的散養戶豬群PRV陽性率較低，這可能是因為與其他地區相比，勐臘縣散養戶的規模較小，養殖密度較低。從生長階段看，勐臘縣不同生長階段豬群都感染了PRV，但感染率不同，感染率由高到低依次為哺乳仔豬、保育豬、母豬、育肥豬和公豬，與國內一些調查結果基本一致[5，8-9]。哺乳仔豬感染率高的原因主要是一些豬場忽視了對哺乳仔豬的免疫，隨著母源抗體的消失，哺乳仔豬及保育豬的易感性增加。

從不同性別豬群看，母豬的陽性率為33.3%，高于公豬的陽性率（20%），這在一定程度上說明了這一時期不同性別的豬對PRV的易感性存在差異。黃曉慧等應用ELISA對安徽地區不同規模化豬場 ? ?2012-2015年采集的豬血清樣品進行豬偽狂犬病病毒野毒株抗體檢測，結果顯示母豬的陽性率為27.46%，公豬的陽性率為22.22%[8]。總之，勐臘縣豬群存在攜帶PRV的情況，且陽性率相對較高，在當前豬病防控的嚴峻形勢下，有必要加強對種豬群的疫病檢測，推行種豬場主要疫病的控制與凈化工作勢在必行。

參考文獻：

[1] 田克恭，人與動物共患病[M].北京：中國農業出版社，2013.

[2] 楊漢春. 2014 年豬病流行情況與2015 年流行趨勢及防控對策[J].豬業科學，2015，32（2）： 38-40.

[3] 吳美芹，呂翠，馬小明，等. 2017年豬偽狂犬的抗體檢測分析與防控建議[J].獸醫實驗室，2018，（2）： 73-76.

[4] Bai Xiaofei， Wang Yuzhou， Xu Xin et al. Commercial vaccines provide limited protectionto NADC3 0 - like PRRSV infection[J]. Vaccine， 2017， 34 （46）： 5540-5545.

[5] 孫哲，晉春霞，劉守川，等. 2017年中科基因對我國豬群常發疫病檢測結果統計與分析[J].中國動物保健，2018，（2）：5-8.

[6]鄭旺華，鄭蘭芬，張勁松，等. 版納小耳豬偽狂犬病感染狀況調查研究[J].現代農業科技，2014，（6）：274-284.

[7] 段文學，普瓊波.4年兩地豬偽狂犬病血清流行病學調查報告[J].中國畜禽種業，2014，（2）：7-8.

[8] 黃曉慧，吳華健，華耀，等. 安徽部分地區規模化豬場偽狂犬病血清流行病學調查[J].動物醫學進展，2017，38（8）：126-130.