基于網絡藥理學的二陳湯“異病同治”機制研究

丁珊珊，康 潔，黃益清，陳華琴，甘慧娟

（福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122）

二陳湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由半夏、陳皮、茯苓、甘草等藥物組成，具有燥濕化痰、理氣和中的功效。 作為中醫經典的化痰方，二陳湯被廣泛應用于臨床，而且療效較為顯著。 包永生等［1］從文獻、臨床、藥理等方面對二陳湯的研究進展進行了綜述，表明二陳湯及其加減方主要用于呼吸系統、消化系統、內分泌系統、神經系統中某些病癥痰證的治療，如慢性阻塞性肺炎（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）等。 那么，二陳湯治療不同疾病痰證的共同之處是什么？ 即二陳湯實現“異病同治”的物質基礎是什么？ 隨著系統生物學和多向藥理學概念的深入，研究者們將網絡藥理學這一新的研究策略引入中醫藥學。 網絡藥理學通過構建中藥成分、靶點與疾病之間的相互作用網絡，對中藥復方的作用機制進行研究，為從整體和系統地解決上述的問題提供了支撐。 因此，本文采用網絡藥理學的方法對二陳湯治療不同疾病（COPD、NAFLD、PCOS）痰證的靶點作用網絡進行生物信息學分析，探討二陳湯“同病異治”的作用機制。

1 方 法

1.1 二陳湯成分收集與篩選 采用中藥系統藥理學平臺［2］（TCMSP，http： ／ ／tcmspw.com ／tcmsp.php），在“herb name”檢索框中分別以“半夏”“陳皮”“茯苓”“甘草”為檢索詞進行檢索，收集這4 味藥的化學成分信息。 對收集到的化學成分以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 為篩選依據，篩選出二陳湯的活性成分。

1.2 二陳湯的作用靶點預測 采用TCMSP 數據庫對篩選出的二陳湯的活性成分進行作用靶點預測，然后利用 UniProt 數據庫（https： ／ ／www.uniprot.org／）中UniProtKB 檢索功能對預測出的作用靶點進行逐一檢索，并在檢索結果中將物種限定為“human”，對所有預測到的二陳湯作用靶點進行一一對應的基因名稱（official gene symbol）轉換，獲得二陳湯活性成分的作用靶點。

1.3 疾病的治療靶點獲取 分別以“chronic obstructive pulmonary disease”“non-alcoholic fatty liver disease”“polycystic ovary syndrome”為檢索詞，在TTD數據庫（http：／ ／db.idrblab.net／ttd ／）、DrugBank 數據庫（https：／ ／www.drugbank.ca／）、PharmGKB 數據庫（https： ／ ／www.pharmgkb.org／）和 GeneCards 數據庫（https： ／ ／www.genecards.org／）進行檢索［3］，得到各個數據庫的疾病治療靶點，并去除重復項，分別獲取COPD、NAFLD、PCOS 三種疾病的治療靶點。 利用Venny 2.1.0 在線工具繪制韋恩圖，將二陳湯的作用靶點與三種疾病的治療靶點進行映射，獲得二陳湯治療這三種疾病的共同靶點。

1.4 網絡的構建與分析 將二陳湯的單味藥-成分信息和成分-靶點信息導入Cytoscape 軟件（版本：3.2.1），分別繪制出二陳湯的單味藥-成分網絡和二陳湯成分-靶點網絡，再利用Cytoscape 軟件中的“Merge”功能，將單味藥-成分網絡和成分-靶點網絡合并成二陳湯成分-靶點網絡［4-5］。 將預測、篩選、映射到的二陳湯治療COPD、NAFLD、PCOS 三種疾病的共同靶點導入到 String 數據庫［6］（https： ／ ／stringdb.org／）“multiple proteins”檢索框中，物種設置為“homo sapiens”，其他參數為默認設置，構建二陳湯-疾病共同靶點之間的相互作用網絡（PPI 網絡），并根據相關參數對PPI 網絡進行分析。

1.5 GO 和KEGG 富集分析 將構建好的PPI 網絡中的核心節點，即共同靶點輸入到David 數據平臺［7］（https：／ ／david.ncifcrf.gov／），選 擇 類 型 為 “official gene symbol”，提交待分析基因列表，在Background中設置背景集為“homo sapiens”，選擇“Functional Annotation Tool”分析工具，對共同靶點進行GO 和KEGG 富集分析。

2 結 果

2.1 二陳湯成分-靶點網絡構建 通過TCMSP 數據庫收集、篩選（OB≥30%、DL≥0.18）出二陳湯活性成分125 個，其中半夏13 個、陳皮 5 個、茯苓 15個、甘草92 個。 對以上活性成分進行靶點預測，剔除未找到作用靶點的活性成分，獲得110 個化合物，其中半夏 12 個、陳皮 5 個、茯苓 6 個、甘草 87 個，見表1。 對所有預測到的作用靶點進行基因名轉換后，保留唯一值，共獲得到259 個預測靶點。 將篩選、轉化后的二陳湯的單味藥、活性成分及作用靶點導入 Cytoscape 軟件（3.2.1 版本）構建二陳湯成分-靶點網絡，見圖1。 該網絡包含371 個節點，其中綠色節點為單味藥（4 個）、黃色節點為活性成分（110 個）、紅色節點為作用靶點（259 個）。

2.2 疾病共同作用靶點獲取 通過TTD、Drug-Bank、PharmGKB 和 GeneCards 數據 庫檢索得到 三種疾病治療靶點，對各個數據庫得到的治療靶點取并集、去重復項后，COPD、NAFLD、PCOS 三種疾病分別獲得 1 631 個、411 個、568 個治療靶點，見表2。將二陳湯的作用靶點和三種疾病各自獲得的治療靶點分別輸入Venny 2.1.0 在線工具繪制韋恩圖，取交集，匹配得到二陳湯治療COPD、NAFLD、PCOS的共同靶點24 個，包括脂聯素（ADIPOQ）、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、小窩蛋白 1（CAV1）、CC 基序趨化因子 2（CCL2）、G1／S 特異性細胞周期蛋白D1（CCND1）、C-反應蛋白（CRP）、細胞色素 P450 3A4（CYP3A4）、前表皮生長因子（EGF）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體（ESR1）、白介素-10（IL-10）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、胰島素（INS）、基質金屬蛋白酶 2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP－9）、原癌基因蛋白（MYC）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸肌醇3-磷酸酶和雙特異性蛋白磷酸酶（PTEN）、前列腺素 G／H 合酶 2（PTGS2）、信號轉導子和轉錄激活子 3（STAT3）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤抗原 p53（TP53）、血管內皮生長因子 A（VEGFA）。 見圖2。

表1 二陳湯活性成分

2.3 相互作用網絡構建與分析 將24 個二陳湯治療COPD、NAFLD、PCOS 三種疾病的共同靶點輸入到String 數據庫，構建出共同靶點的PPI 網絡模型，見圖3。 該PPI 網絡包含24 個節點（即共同作用靶點），246 條節點連接線（連接線表示兩個節點之間存在相互作用，粗細代表相互作用關系的強弱）。 經計算分析，該網絡平均度值為20.5（度值表示某一個節點與其他節點的連接數，度值越大，連接的節點數越多），其中 VEGFA、TP53、INS、IL-6、TNF、STAT3、PTGS2、MMP-9、MMP-2、CCL2、AKT1、ESR1、EGF、IL-10、PPARG 和 EGFR 等 16 個節點的度值高于平均度值，為該網絡的關鍵靶點。

圖1 二陳湯成分-靶點網絡圖

表2 三種疾病相關靶點數

2.4 GO 富集分析 通過David 數據平臺對24 個共同靶點進行GO 富集分析，獲得P＜0.05 的GO 條目 237 個，其中生物學過程（biological process，BP）條目 204 個、細胞學組分（cellular components，CC）條目 10 個、分子生物學功能（molecular function，MF）條目 23 個，展示 BP、CC 和 MF 分別富集到的基因數目排名前十的條目，見圖4。 這24 個共同靶點主要參與RNA 聚合酶II 啟動子轉錄調控、基因表達調控、細胞增殖與凋亡調控、轉錄調控、一氧化氮生物合成、蛋白質磷酸化調控、MAPK 和ERK 級聯、炎癥反應、信號轉導、血管生成、葡萄糖穩態、衰老等生物學過程。

2.5 KEGG 信號通路富集分析 通過David 數據平臺對24 個共同靶點進行KEGG 信號通路富集分析，根據P＜0.05 篩選到69 條信號通路，列出富集到的基因數目排名前20 條的信號通路，見表3。 24個共同靶點涉及到的信號通路類型主要有信號轉導通路 （PI3K-AKT 信號、FoxO 信號、HIF-1 信號、TNF 信號、MAPK 信號、JAK-STAT 信號等）、癌癥相關通路（膀胱癌、子宮內膜癌、小細胞肺癌等）、肝病相關通路（乙型肝炎、非酒精性脂肪肝）和胰島素抵抗等。

圖2 二陳湯-疾病共同作用靶點韋恩圖

圖3 共同作用靶點PPI 網絡圖

圖4 共同靶點的GO 富集分析圖

表3 KEGG 信號通路富集分析結果（前20）

3 討 論

COPD 是以不可逆的氣流受限為特征的慢性呼吸系統炎癥性疾病，中醫認為COPD 多以肺、脾、腎虛虧為本，以痰濁、血瘀阻絡為標；NAFLD 則是與胰島素抵抗密切相關的代謝性肝臟損傷，其基本病機是脾失健運、聚濕成痰、痰濕內蘊；而PCOS 是育齡期婦女多發且具有多因性、表現多態性的一組綜合征，主要由脾腎兩虛、肝氣郁滯、痰濕內阻引起。二陳湯是經典的祛痰祖方，臨床上經常被作為基礎方用于治療痰濕證［8-10］。中醫提倡從整體出發，辨證論治，是臨床上“異病同治”的依據。 中藥復方對證治療、多成分多靶點的協同作用，是實現“異病同治”的手段。 然而，因中藥復方的多途徑多效應特征，使其作用機制的研究受到挑戰。 近年來，隨著網絡藥理學的發展，將已知中藥活性成分與疾病治療靶點聯系起來，能夠從系統的角度探討中藥復方治療疾病的機制［11-13］。 因此，本文采用網絡藥理學的方法對二陳湯異病同治COPD、NAFLD、PCOS 的內在機制進行分析。

本研究對二陳湯中四味中藥的活性成分進行查詢、篩選，獲得110 個化合物，其中半夏12 個、陳皮5 個、茯苓 6 個、甘草 87 個，主要包含黃酮類化合物（黃芩苷、黃芩素、刺芒柄花素、光甘草素、光甘草定、柚皮素、橙皮素、川陳皮素、槲皮素、甘草苷、光甘草定等）、三萜類化合物（松苓新酸、16α-羥基松苓新酸、常春藤皂苷元、白樺脂酸等）、甾醇類化合物（豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、星魚甾醇等），這些化合物已被報道具有抗癌、抗炎、抗細菌和抗氧化等生物學活性［5，14］。 這些活性成分共預測、篩選出259 個作用靶點，與查詢、篩選出的 COPD（1 631 個）、NAFLD（411 個）、PCOS（568 個）的疾病治療靶點匹配得到共同作用靶點24 個。

經 KEGG 信號通路分析富集到 PI3K-AKT、FoxO、HIF-1、TNF、MAPK、JAK-STAT、胰島素抵抗和癌癥相關等主要的信號通路。 這些信號通路在COPD、NAFLD、PCOS 治療和機制研究中均有報道，且通路之間存在著交互作用。 PI3K-AKT 信號通路在調節細胞生長、代謝中具有關鍵作用，被PI3K 磷酸化的AKT 能夠磷酸化很多底物分子，從而調控多種生物學效應。 研究表明通過調節PI3K／AKT 信號通路，可以減輕胰島素抵抗，從而治療和改善NAFLD［15-16］和 PCOS［17-18］，也能夠減輕 COPD 的肺部和全身炎 癥反應［19-20］。 FoxO 作為信號通路下游的關鍵調控因子，參與調節葡萄糖、甘油三酯和膽固醇穩態等一系列細胞功能，FoxO 的失調與 NAFLD 的發生有關［21］；PCOS 患者巨噬細胞中激活TLR4 炎癥信號通路的FoxO-1 磷酸化水平受到 AKT 的抑制［22］；FoxO3 在肺炎癥反應和抗氧化基因的調控中起關鍵作用，FoxO3 缺乏可導致 COPD 的發生［23］。 HIF-1 是低氧適應的關鍵決定因素，可以防止NAFLD 進展過程中肝臟過度的脂肪積聚［24］；HIF-1α 在 COPD 中 過表達，可能通過激活EGFR／PI3K／AKT 途徑上調炎癥因子的表達［25］；HIF-1α 信號 通路可能參 與了PCOS 患者子宮內膜功能障礙的分子機制［26］。MAPK信號通路跟炎癥、凋亡、分化密切相關，研究顯示調節MAPK-JNK／P38 信號通路可改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠的NAFLD，減輕炎癥反應［27］，激活PI3K／AKT 和抑制MAPK 途徑降低大鼠模型系統的PCOS病理 和 胰島 素抵抗［28］，p38MAPK 和 ERK1 ／2 可以通過增加 MAFbx／Atrogin 和 MuRF1 的水平而調節肌肉蛋白的降解和萎縮［29］。 因此，二陳湯可通過交互調節 PI3K-AKT、FoxO、HIF-1、MAPK 等信號通路對炎癥反應、胰島素抵抗、糖脂代謝、平滑肌增殖等生物學過程進行調整，從而起到化痰理氣的功效。

本文采用網絡藥理學的思路和方法，從整體和系統的角度探討二陳湯化痰的物質基礎及其“異病同治”的內在機制。 然而，由于目前中藥復方成分信息和生物信息學數據庫仍不完善，在一定程度上限制了網絡藥理學分析的結果，因此對于分析結果需要進一步的實驗驗證［30-31］。