寒熱型哮喘大鼠支氣管平滑肌鈣通道開放概率的差異

陳志斌 ，吳麗嬌 ，王春娥 ，陳可強

（1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州350003；2.福建省中醫藥科學院，福建 福州350003）

支氣管哮喘（哮喘）是臨床常見的慢性氣道炎癥性疾病，主要以慢性氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應性為特征。 近年來，人們逐漸認識到氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs））在哮喘發病機制中的重要性。 ASMCs 不僅具備增殖能力，還可釋放細胞因子、趨化因子、生長因子和血管生成因子［1］。 此外氣道高反應通過 ASMCs 介導，與Ca2+濃度相關［2］。 氣道平滑肌的收縮依賴于細胞內Ca2+濃度的升高，并且Ca2+參與平滑肌的興奮耦聯過程。 支氣管平滑肌細胞（bronchial smooth muscle cells，BSMCs）是 ASMCs 主要組成部分，維持支氣管正常的舒張收縮功能。 哮喘在中、西醫診斷中均有各自分型，指導著臨床治療，而大量研究及臨床實踐證明中西醫結合治療療效顯著，因此本課題通過研究哮喘機制方法區分中醫哮喘證型差異性，為哮喘治療提供更精確的診斷依據。 中醫哮喘急性期多以寒哮、熱哮型為主，而鈣通道是氣道上細胞重要的離子通道之一，研究中醫哮喘證型鈣通道開放概率的差異性對臨床證型診斷有重要意義。 本實驗通過分離培養寒、熱型哮喘SD 大鼠模型，采用膜片鉗技術細胞貼附式方法檢測BSMCs 內鈣通道開放概率，研究寒、熱型哮喘大鼠BSMCs 鈣通道變化，探討其在寒熱型哮喘發病中的意義。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級5～6 周齡健康雄性大鼠，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場，生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0001，動物合格證編號：201908685。 飼養于SPF 級動物實驗室，恒溫恒濕，模擬標準日夜系統（12 h 光照／12 h 黑夜），予以自由飲食及飲水。

1.2 主要試劑 雞卵清白蛋白（VOA）、脂多糖、木瓜蛋白酶（美國 Sigma 公司，貨號：A5503、S0130、P4762）；戊巴比妥鈉（上海隆盛化工有限公司，CAS：57-33-0）；PBS 緩沖液（南京生興生物有限公司，貨號：SN331）；I 型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司，貨號：C8140）；胰酶、牛血清白蛋白（美國 Hyclone 公司，型號：SH30042.01、SH30070.03）；DAB 顯色液、小鼠二抗（丹麥 DAKO 公司，貨號：K3468、K4001）；蘇木素（珠海貝索生物技術有限公司，貨號：BA-4097）；氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氫氧化鋁（上海凌峰化學試劑有限公司，貨號：7447-40-7、10043-52-4、7786-30-3、21645-51-2、21645-51-2）；多聚甲醛（南京化學試劑股份有限公司，貨號：C0671510223）；HEPES 緩沖鹽水（上海欽誠生物科技有限公司，貨號：QC25-02540）；小鼠一抗（英國 Abcam 公司，貨號：ab7817）。

1.3 主要設備 霧化機（廣東粵華醫療器械廠有限公司）；DMEM 培養基（美國 Hyclone 公司）；T-25 培養瓶（美國 Corning 公司）；CO2培養箱（美國 Thermo fisher 公司）；熒光倒置顯微鏡（日本 Nikon 公司）；微電極推制器、BF150-86-10 Sutter 玻璃管（美國Sutter 公司）；膜片鉗放大器、數模／模數轉換卡、低通濾波器、微型計算機軟件（美國Axon 公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及模型建立 參照參考文獻［3-5］。將18 只大鼠按數字表法隨機分為正常對照組、寒哮組、熱哮組，每組各6 只，自由攝食、飲水7 d 后開始造模。 大鼠分別于造模第1 天和第8 天腹腔注射VOA 和氫氧化鋁混懸液1 mL（雞卵清白蛋白100 mg和氫氧化鋁干粉100 mg 溶于1 mL 的生理鹽水中）致敏誘喘，出現呼吸加快、豎毛、前肢縮抬、點頭呼吸等。① 熱哮組：第1 天和第8 天采用0.4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，用移液管取脂多糖稀釋液40 μL于雙側鼻孔滴鼻；第15 天開始以1%VOA 溶液超聲霧化，每次30 min，每日1 次，連續7 d。以大鼠出現煩躁、汗多、口渴、點頭、節律性收腹樣喘促等現象，提示造模成功。 ② 寒哮組：第15 天開始，將大鼠放入霧化箱內，以1%VOA 超聲霧化激發，每次30 min，每天1 次；同時將大鼠放入寒箱內（0～2℃），每次20 min，每天 1 次，連續 7 d。 將大鼠激發至哮喘發作，出現點頭、身體顫抖、節律性收腹樣喘促現象等，表明造模成功。 造模成功后，繼續霧化激發及寒冷刺激4 周。③ 正常對照組：以生理鹽水1 mL 取代卵蛋白生理鹽水混懸液進行腹腔注射； 第15 天開始，以生理鹽水超聲霧化激發。

2.2 支氣管平滑肌的分離 腹腔注射大劑量戊巴比妥鈉將3 組大鼠處死后，將肺取出，置于含雙抗的PBS 緩沖液中漂洗，分離大鼠兩側肺組織中3～4 級支氣管，剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊；加入 2 mg／mL 型膠原酶和 2.5 mg／mL 木瓜蛋白酶，置于 37 ℃培養箱中消化90 min，1 000 rpm 離心8 min，去除上清，加入0.125%胰酶37 ℃消化 5 min，加入含血清的DMEM 培養基終止消化，1 000 rpm離心8 min，去除上清，加入含血清的DMEM 培養基重懸細胞，用100 目篩過濾，用DMEM 培養液反復沖洗、離心2 次，即可得到含支氣管平滑肌細胞的細胞懸液；將細胞懸液接種至T-25 培養瓶中，放入培養箱中培養；3 d 后，更換培養基，待細胞長至80%～90%融合度時，使用胰酶將細胞消化下來接種至3 個培養瓶中，培養2～3 代的細胞用于實驗。

2.3 免疫組化鑒定 將分離的大鼠BSMCs 鋪板于培養皿內，制作細胞爬片，培養24 h 后，去除培養液，PBS 緩沖液清洗后加入多聚甲醛固定30 min；吸去多聚甲醛后，PBS 洗3 次后加入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶；PBS 洗 3 次，每次 5 min，吸去 PBS 后加 5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min（封閉電荷）；去除BSA液，每孔加入 100 μL 1∶200 稀釋的一抗，4 ℃過夜，PBS 洗 3 次后每孔加 100 μL 的二抗，37 ℃孵育 30 min；PBS 洗 3 次后，每張切片加 50～100 μL 新鮮配制DAB 溶液，顯微鏡控制顯色；顯色完全后，蒸餾水洗，蘇木素復染，吸去蘇木素，水洗，鏡下拍照。

2.4 BSMCs 的鈣通道開放概率記錄 運用膜片鉗技術細胞貼附式方法測定不同Ca2+濃度BSMCs 內鈣通道開放概率。 調節P-1000 拉制儀參數（RAMP-20），使得BF150-86-10 中空硅玻璃管入水阻值達到8.0～10.0 兆歐；從培養箱中取出細胞，置于BSMCs外液（氯化鈉 130 mmol／L、氯化鉀 5 mmol／L、氯化鈣1 mmol／L、氯化鎂 1 mmol／L、HEPES 緩沖鹽水 20 mmol／L，pH7.4）；用微電極電阻約為 3 兆歐，單通道電流經膜片鉗放大器放大，探頭反饋電阻為10 千兆歐，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。 數據采集與分析：由計算機軟件控制產生數字脈沖，經數／模（D／A）轉換成模擬脈沖電壓信號， 控制細胞的膜電位，電流信號通過0.1 千兆歐探頭，經膜片鉗放大器的電流電壓轉換輸入到模／數轉換卡變成數字信號，再經數據采集系統微型計算機軟件，采集程序輸入計算機。

2.5 統計學方法 運用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析。 計量資料符合正態分布的以（±s）表示，組間比較采用t 檢驗；不符合正態分布的采用秩和檢驗，以［M（P25，P75）］表示。

3 結 果

3.1 3 組鈣通道開放概率比較 Ca2+濃度為0.5、1、3、10 μmol／L 時，3 組鈣通道開放概率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 Ca2+濃度為 100 μmol／L 時，熱哮組和寒哮組鈣通道開放概率均較正常對照組升高（P 均＜0.01），熱哮組鈣通道開放概率較寒哮組升高更明顯（P＜0.01）。 見表1。

表1 3 組鈣通道開放概率比較［（±s）／M（P25，P75）］

表1 3 組鈣通道開放概率比較［（±s）／M（P25，P75）］

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與寒哮組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組寒 哮 組熱 哮 組n 6 6 6 0.5 μmol／L 0.12±0.34 0.12±0.27 0.13±0.02 1 μmol／L 0.12±0.53 0.15±0.01 0.12±0.02 Ca2+濃度3 μmol／L 0.17±0.04 0.18±0.37 0.21±0.40 10 μmol／L 0.35（0.23，0.52）0.46（0.36，0.46）0.42（0.37，0.43）100 μmol／L 0.45（0.42，0.55）0.58（0.56，0.61）1）0.68（0.61，0.70）1）2）

4 討 論

ASMCs 參與哮喘氣道炎癥、氣道重塑及氣道高反應性的發生與發展過程。 目前，對于哮喘研究大多集中于整個氣道，而針對BSMCs 的研究較少涉及。鈣通道是引起氣道平滑肌收縮的主要通道［6］，游離鈣是細胞內第二信使，細胞的存活及其功能的維持依賴于細胞內Ca2+的精密調節，細胞內Ca2+濃度升高對ASMCs 起維持和收縮作用。 鈣通道開放增加，使細胞內Ca2+濃度升高，引起氣道平滑肌收縮［7］，而氣道平滑肌的收縮增強被認為可能是哮喘發生氣道高反應的重要原因，臨床上應用支氣管擴張劑可改善哮喘發作引起氣道攣急、呼吸困難等癥狀，進一步說明了氣道高反應與ASMCs 收縮有關。哮喘患者ASMCs 鈣通道開放增加，細胞內Ca2+濃度增加可使得哮喘患者氣道的ASMCs 處于無收縮的活性增加狀態，從而導致氣道高反應性，此時輕微的刺激即可誘發氣道的痙攣［8］。 祖國醫學將哮病急性發作期分為熱哮、寒哮兩個證型［9］，寒哮治以宣肺散寒、化痰平喘為主，熱哮治以清熱宣肺、化痰定喘為主，二者的治法存在明顯區別。 同為哮喘病，中醫分型治法卻明顯不同，寒哮、熱哮是否為哮喘病的2 個亞型？ 在不同鈣濃度分布下鈣通道開放概率兩者是否存在差異性？ 因此，本試驗運用膜片鉗技術細胞貼附式方法檢測寒、熱型哮喘SD 大鼠BSMCs 內鈣通道開放概率的變化，探討寒哮、熱哮之間的差異。

本研究結果表明：隨著Ca2+濃度的增加，寒、熱型哮喘大鼠鈣通道開放概率也不斷地增加，熱哮組、寒哮組較正常對照組鈣通道開放概率增加明顯，說明鈣通道開放概率的變化可作為哮喘的分型指標。當 Ca2+濃度為 100 μmol／L 時，寒、熱型哮喘大鼠的鈣通道開放概率增加程度較正常對照組明顯，且熱哮組鈣通道開放概率較寒哮組明顯增加，說明寒、熱型哮喘大鼠在不同鈣濃度下鈣通道開放概率有本質上的差異。 因此，鈣通道開放概率明顯增加，臨床應考慮熱哮的可能，鈣通道開放概率輕度增加時，臨床上應考慮寒哮的可能。 今后，我們將進一步深入研究，探討鈣通道開放概率對寒、熱哮診斷的具體折點，以期通過對鈣通道開放概率的測定，作為寒熱哮的診斷指標。