內質網應激的信號通路及其與肝臟疾病的關系

李 姚， 王志鑫， 溫 浩， 王海久， 才讓東智， 于文昊， 張 麗， 樊海寧

1 青海大學研究生院， 西寧 810000； 2 青海大學附屬醫院 肝膽胰外科， 西寧 810000；3 青海省包蟲病研究重點實驗室， 西寧 810000； 4 新疆醫科大學第一附屬醫院， 烏魯木齊 830001

1 內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及相關通路

1.1 生物學特性 內質網是哺乳動物一種重要的細胞器，其膜結構占細胞內膜的1/2，在內膜系統中也占有重要中心地位。ERS一方面是為了激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)以抵制應激誘因造成的有害影響，另一方面UPR不足時可以重建內質網穩態，UPR信號通路是通過細胞凋亡途徑而引起細胞損傷甚至死亡[1]。各種損傷因素作用于內質網，引起蛋白質加工/運輸障礙或攝取/釋放Ca2+障礙，導致內質網腔內錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及細胞內Ca2+平衡紊亂，進而激活UPR。UPR可通過某些特定基因的轉錄而增強蛋白質折疊的能力，保持內質網穩態，維持細胞正常功能[2],當穩態不能重建時，UPR信號轉導途徑將引發細胞凋亡。內質網膜上存在3種感受腔內未折疊蛋白堆積的感受器蛋白：蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)、肌醇需求酶1(IRE-1)、活化轉錄因子6(ATF6)[3]。

1.2 ERS的3種信號轉導通路

1.2.1 PERK通路 PERK是位于內質網中的一種Ⅰ型跨膜蛋白，是真核起始因子2α (eIF2α)激酶家族成員之一。在正常情況下，PERK作為單體存在，處于非活性狀態，與內質網伴侶蛋白GRP78/BiP結合。ERS發生時，BiP與PERK解離[4]，PERK通過低聚和反式自磷酸化激活。激活磷酸化eTF2α，導致平動衰減。磷酸化eIF2α翻譯激活活化的轉錄因子4(ATF4)mRNA和ATF且誘發UPR目標基因的表達，參與氨基酸代謝、抗氧化反應、ERS誘導凋亡[3,5]。其中ATF4是環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子(CREB)家族成員，能結合ATF/CRE元件序列5′-TGACGTCA-3′和氨基酸反應元件的核心序列5′-ATTGCATCA-3′，可進一步調控GRP78、GRP94、GADD34、CHOP、ATF3、P58IPK、EDEM及PDI等的表達[6-7]。并且產生的GADD34可與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的抑制劑形成復合物，促進eIF2α去磷酸化，恢復蛋白質合成，從而形成負反饋調節環[7]。

1.2.2 IRE-1通路 IRE-1是一種具有RNase結構域的Ⅰ型跨膜蛋白，帶有絲-蘇氨酸激酶和核酸內切酶的活性， 包括IRE-1α和IRE-1β兩種亞型。在正常情況下，IRE-1通過與BiP結合而作為單體存在。在ERS下，BiP與IRE-1解離，IRE-1通過低聚和反應自磷酸化被激活。激活的IRE-1啟動其RNase活性，催化非常規剪接X盒結合蛋白1(X-box-binding protein-1，XBP1)mRNA，合成剪接的活性轉錄因子[8], XBP1屬于CREB/活化轉錄因子家族成員。 XBP1誘導參與內質網相關性降解(endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD)和脂質合成的UPR靶基因表達以及內質網伴侶蛋白的表達[3,9]。相關研究發現 IRE-1α或 XBPl 敲除的細胞會表現出ERAD方面的功能缺失，說明IRE-1α/XBP1信號通路與ERAD功能有關。

1.2.3 ATF6通路 ATF6是內質網的一種Ⅱ型跨膜蛋白，是一種堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子[10]。ATF6包含內質網腔內、跨膜區和胞質3個結構域，其N端駐留于胞質中，有一個bZIP的DNA轉錄激活域；C端駐留于內質網腔內，能夠感應內質網膜中未折疊蛋白聚集傳來的信號[11]。在正常情況下，由于ATF6的高爾基定位信號被BiP覆蓋，抑制了ATF6向高爾基體的易位。在內質網脅迫下，ATF6從BiP中釋放并轉移到高爾基體。在高爾基體中，ATF6被位點1蛋白酶和位點2蛋白酶裂解[12]，然后ATF6的功能片段被釋放到胞質中[13]。這個片段轉移到細胞核，誘導內質網伴侶蛋白、ERAD和 XBP1的表達。

2 ERS與乙型肝炎

乙型肝炎是由HBV感染引起的肝臟炎性狀態，常是肝細胞癌(HCC)的發病機制[14]。雖然已有許多關于HBV在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝炎、肝硬化、HCC等發病機制中的報道，但其機制尚未完全了解。到目前為止，有關ERS介導HBV突變的綜述僅限于一種特定的突變型: preS2缺失。

許多研究認為preS突變體(LHBs和MHBs)在肝臟疾病中的作用機制與ERS明顯相關。preS1和preS2突變體都有分泌表面蛋白的缺陷，這種突變體在內質網中積累導致磨玻璃肝細胞的形成，這是慢性乙型肝炎感染的組織學標志。Pollicino等[15]篩選了40例未經治療的慢性乙型肝炎患者，其中有14例(35%)患者表現出單一或多個preS/S突變。他們發現preS/S突變體和分泌HBsAg水平呈負相關。在最近的一項研究中，Montalbano等[16]證實了被ERS信號激活轉染的肝細胞(Huh7和HepG2細胞)含有包含HBV的突變包膜蛋白(pSVL質粒在preS1中發生突變，pSVM質粒在preS2中發生突變)。免疫熒光顯微鏡顯示LHBs在兩種細胞系中均定位于內質網，僅有部分MHBs共定位于內質網腔；該研究還表明，LHBs和HBsAg的比例對于HBsAg和病毒粒子的分泌是必要條件之一。在這方面，Ou等[17]也發現過表達含有preS1的LHBs阻礙了HBsAg的分泌。Bock等[18]檢測了3種preS區域的自然突變:MUT1(CCAAT box中的一個點突變)、MUT2 (CCAAT盒中的一個6 bp缺失)和MUT3 (preS2區域中的一個153 bp缺失)。他們在內質網中發現了突變S蛋白的積累。此外，Ou等[17]報道了pSVL和pSVM質粒提高了GRP78和CHOP在Huh7細胞系中的表達，IRE-1α和ATF4水平沒有發生顯著變化，免疫熒光數據同樣顯示GRP78增加。此外，Huh7在轉染pSVM的細胞時GRP78的表達水平增加了2.0倍，pSVL組表達水平無明顯變化。與陽性對照細胞和TG-treated細胞相比，pSVM和pSML轉染的Huh7細胞顯示XBP1被激活。不僅IRE-1α/XBP1被激活，而且PERK也被pSVL和pSVM激活，PERK和eIF2α的磷酸化高度增加。這些數據表明突變的HBV包膜蛋白激活了肝細胞ERS通路。在HBV感染者中，ERS介導乙型肝炎可以歸納為3個方面:(1)內質網中存在preS1和preS2突變體并誘導ERS，同時誘導ERS伴侶GRP78升高起到保護作用；(2) preS突變會影響S基因的調節，導致乙型肝炎的發生；(3)HBV基因組突變可產生多種HBV編碼蛋白的突變類型，這些突變主要通過增加突變蛋白的積累來增強受感染肝細胞的ERS。總體而言，了解HBV如何誘導內質網損傷及其機制將為慢性乙型肝炎患者提供新的治療選擇。

3 ERS與肝衰竭

肝衰竭包括急性肝衰竭、亞急性肝衰竭、慢加急性(亞急性)肝衰竭和慢性肝衰竭。肝衰竭為當今國內外研究的難點，其發病機制仍未完全明確。張向穎等[19]應用D-氨基半乳糖( D-GalN )和脂多糖(LPS)誘導大鼠肝衰竭模型，對照組同步注射等體積的生理鹽水進行比較。通過采用免疫組化及RT-PCR方法檢測兩組肝組織Caspase-12、IRE-1、NF-κB、NF-κB誘導的激酶(NIK)表達情況，采用常規HE染色、流式細胞技術觀察肝細胞凋亡情況,分析內質網跨膜蛋白IRE-1與肝細胞凋亡程度、Caspase-12的相互關系及Caspase-12與肝細胞凋亡程度的相互關系，結果表明隨著肝臟病理損傷的加重肝組織中IRE-1α、Caspase-12表達增加,IRE-1α與Caspase-12、細胞凋亡率以及Caspase-12與細胞凋亡率均呈明顯正相關, IRE-1α/ TRAF2/ Caspase-12介導的信號轉導通路是ERS導致暴發性肝衰竭中肝細胞凋亡的重要機制之一。在暴發性肝衰竭中,隨著肝臟病理損傷的加重肝組織中NF-κB表達增加,且與肝細胞凋亡率呈明顯正相關,從細胞、蛋白、基因水平證實NF-κB在暴發性肝衰竭肝細胞凋亡中起重要作用。并且證明了肝衰竭肝組織中NF-κB p65與IRE-1α呈明顯正相關,但與NIK之間無相關性。提示NF-κB可能在ERS信號轉導通路中起重要作用,但在IRE-1α/TRAF2/NF-κB這一信號轉導通路中,連接TRAF2與NF-κB的信號轉錄分子NIK對NF-κB p65無明確調控作用。

最近有研究[20]發現在四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠肝衰竭模型中，肝臟 NF-κB p65 易位和eIF2α磷酸化顯著增加，ERS抑制劑4-基丁酸干預后可以明顯抑制小鼠肝損傷。在 N-乙酰氨基酚(APAP) 誘導的藥物性肝衰竭中，APAP能夠誘導ERS肝損傷和肝細胞死亡，ERS特異性凋亡基因CHOP敲除小鼠進行膽管結扎，肝臟炎癥反應激活，4-基丁酸抑制ERS顯著改善 APAP誘導的小鼠肝損傷。CCl4誘導的藥物性急性肝衰竭小鼠模型中，ATF4 減少促進急性肝損傷。在慢性乙型肝炎重癥化引發的慢加急性肝衰竭中，ERS誘導保護性的UPR在慢性乙型肝炎中被激活，而在肝衰竭期間則失活，但是嚴重ERS誘導的相關凋亡蛋白隨著肝衰竭發生而逐漸高表達；動物實驗[21]表明，ERS在 D-GalN / LPS 誘導的急性肝衰竭動物模型中被引發，4-苯基丁酸抑制ERS可以顯著抑制炎癥反應并減輕急性肝衰竭肝損傷，細胞實驗表明，ERS協同 LPS 激活 Toll樣受體4，誘導促炎因子的大量產生。綜上所述，在肝衰竭患者中，ERS相關伴侶蛋白的表達增加與ERS參與暴發性肝衰竭肝細胞凋亡的發生發展有關。ERS在肝損傷方面起到保護作用，抑制ERS可以調節炎癥反應，降低肝損傷發生率。ERS是肝衰竭參與機制之一，有利于研究出更多治療肝衰竭的方法。

4 ERS與HCC

ERS促進腫瘤細胞逃避免疫監測，潛在的具體機制仍然未知[22]。Liu等[23]研究證明ERS誘導HCC細胞釋放外泌體，外泌體通過調節程序性死亡配體1(PD-L1)的表達來減弱抗腫瘤免疫。ERS的標志物GRP78、ATF6、TRE-1α在HCC組織中表達上調并與HCC患者的總生存期和AFP臨床評分呈負相關。ERS相關蛋白表達與HCC組織CD68+巨噬細胞募集及巨噬細胞PD-L1表達呈正相關。定量PCR分析經衣霉素處理的HCC細胞中miRNA-23a-3p(外泌體中最豐富的miRNA之一)，其水平與總生存率呈負相關。外泌體衣霉素處理組可上調巨噬細胞中PD-L1的體內外表達。生物信息學分析表明，miRNA-23a-3p通過磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)-磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶(PI3K/PKB)通路調控PD-L1表達。體外轉染和共培養實驗顯示miRNA-23a-3p抑制了巨噬細胞中PTEN的表達。Huang等[24]研究發現姜黃素可誘導人癌細胞中ATF6、ATF4和CHOP等表達增高，引起細胞凋亡。日柏醇可誘導人癌細胞中UPR信號通路相關基因表達，促使細胞發生凋亡[25]。HCC細胞HepG2在衣霉素誘導下發生應激反應且細胞凋亡增多，進一步說明了ERS在誘導HCC細胞凋亡中的作用。Jin等[26]研究發現，小鼠給予六價鉻喂養后，取肝組織檢測顯示GRP78、ATF6和CHOP不僅與索拉非尼在HCC治療中產生耐藥有關，還影響著抗腫瘤藥物對HCC的治療效果[27]。Guo等[28]報道，ERS中CHOP途徑在山奈酚誘導的HCC細胞凋亡中發揮重要作用，抑制劑的作用下HCC細胞可免受ERS誘導的細胞凋亡。總結ERS在HCC中產生的機制：(1)ERS誘導HCC細胞釋放外泌體，外泌體通過調節巨噬細胞PD-L1的表達來減弱抗腫瘤免疫；(2)ERS在HCC細胞中釋放外泌體，上調巨噬細胞中PD-L1的表達，進而通過miRNA-23a-PTEN-AKT外泌體途徑抑制T淋巴細胞功能。(3)HCC可通過激活UPR來順應各種不利環境，促進HCC適應缺氧環境，有利于腫瘤細胞的存活。因此，ERS的發生及其誘導HCC細胞凋亡機制有可能為研究新的抗肝癌靶點提供新思路。

5 ERS與肝棘球蚴病

肝包蟲病是牧區較常見的寄生蟲病，亦稱肝棘球蚴病，此病仍然是一個公共衛生問題，分布于世界范圍內。阿苯達唑是目前唯一用于包蟲病術前術后的口服藥物。然而，由于其療效低、并發癥多，找到新的治療藥物成為世界級挑戰[29]。Nicolao等[30]發現硼替佐米(bortezomib，BTZ)分別在5 μmol/L和0.1 μmol/L濃度下對囊型包蟲病小鼠的原頭節和后絳幼蟲存在影響，結果顯示在小鼠接觸藥物96 h后殺死了50%的幼蟲;使用BTZ 8 d后原頭蚴死亡率為100%，其半抑制濃度(IC50)為(14±3)μmol/L。BTZ目前作為一種用于骨髓瘤化療的蛋白酶體抑制劑，研究表明在0.6 μmol/L的半最大效應濃度(EC50)劑量下對多房棘球蚴蟲具有高水平的殺傷作用。BTZ處理的多房棘球蚴會導致泛素化蛋白的積累和寄生蟲死亡[31]。寄生蟲細胞內結構的蛋白酶體可能是靶點，因為其參與細胞分化、增殖、包囊形成、幼蟲侵襲的調控。抑制蛋白酶體干擾內質網的穩態，影響蛋白質的折疊，并通過轉錄誘導ERS相關標志物的表達。在真核生物進化過程中，UPR傳感器增加時只有IRE-1/XBP1在酵母菌中發出信號。在秀麗隱桿線蟲和黑腹線蟲中，有3個分支在它們的基因組中編碼，但只有2個是功能性的(IRE-1/XBP1和PEK1)，而在哺乳動物中IRE-1、PERK和ATF6通路均可在ERS中調節穩態[32-33]。特別是缺乏內質網傳感器IRE-1/XBP1和ATF6的細胞內寄生蟲，如利什曼原蟲、弓形蟲和錐蟲等，同樣通過PERK識別錯誤折疊的蛋白進行UPR。Mori[34]通過對棘球絳蟲基因組的生物信息學和轉錄組分析，發現棘球蚴可能具有所有這些功能蛋白。Nicolao等[30]通過RT-PCR和real-time PCR也展示了UPR信號IRE-2和XBP1基因在細粒棘球絳蟲原節段中的表達并觀察到BTZ治療后的上調，證明了BTZ對寄生蟲的有害作用，UPR的激活加劇了寄生蟲的死亡；研究還表明，在正常生長條件下，Eg-GRP78和Eg-calnexin基因在兩種幼蟲形態中均表現出較高的基礎表達水平，而在BTZ處理后的原頭蚴中僅表現出顯著的基因上調，證實了ERS和UPR的激活。令人驚奇的是，在蛋白質合成速率超過原節段的元莢體細胞，Eg-GRP78等伴侶蛋白在BTZ反應下的表達增加并不明顯。因此，在這種幼蟲形態中，伴侶蛋白和UPR轉導蛋白的低表達可以解釋BTZ在低濃度下的高敏感性。ERS與肝包蟲病研究內容仍然缺乏，上述只能證明內質網伴侶蛋白和UPR轉導蛋白mRNA的增加以及BTZ誘導細粒棘球絳蟲產生ERS和自噬。希望在不久的將來，ERS機制及其藥理調控途徑能成為治療肝包蟲病的新思路。

6 小結

綜上所述，ERS過程復雜，其在肝臟疾病中扮演著重要角色。ERS可以保護細胞，避免未折疊蛋白過多而使肝組織發生病理損傷。如UPR可通過某些特定基因的轉錄而增強蛋白質折疊的能力，保持內質網穩態，維持細胞的正常功能。當UPR不足時，外源性刺激則會導致肝細胞的損傷。目前，ERS的許多方面尚不清楚，隨著對ERS與肝臟疾病關系的研究逐漸深入，有助于從細胞及分子水平進一步了解肝臟疾病的發生發展機制，為探索肝臟疾病的免疫治療提供新的策略。