循環(huán)游離DNA在肝癌和肝相關(guān)性寄生蟲病中的應(yīng)用進(jìn)展

后亞軍， 張靈強(qiáng)， 樊海寧

1 青海大學(xué) 研究生院， 西寧 810000； 2 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科， 西寧 810000；3 青海省包蟲病重點(diǎn)研究實(shí)驗(yàn)室， 西寧 810000

Mandeld等[1]在1948年首次報(bào)道循環(huán)游離DNA(circulating free DNA，cf-DNA)，是指在非細(xì)胞成分中發(fā)現(xiàn)DNA片段。這一發(fā)現(xiàn)的意義幾十年來一直不為人所知。直到1977年，Leon[2]發(fā)現(xiàn)癌癥患者的血液中cf-DNA濃度增加。10年后，Stroun等[3]發(fā)現(xiàn)cf-DNA來源于癌細(xì)胞，這一結(jié)果得到了Sorenson等[4]的驗(yàn)證，該研究通過等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在血漿cf-DNA檢測(cè)出突變的KRAS癌基因序列。經(jīng)過多半個(gè)世紀(jì)的研究，為cf-DNA的臨床應(yīng)用打開了大門。

1 cf-DNA的來源

目前研究[5]發(fā)現(xiàn)，cf-DNA通過細(xì)胞凋亡和壞死被釋放到血液循環(huán)中，或通過活性細(xì)胞分泌以及寄生蟲感染導(dǎo)致免疫反應(yīng)引起的炎癥衍生DNA片段進(jìn)入血液循環(huán)中。此外，cf-DNA在其他體液中也有發(fā)現(xiàn)(包括唾液、腦脊液及尿液等體液中)[6-9]。最初認(rèn)為血液中較高水平的cf-DNA可能是腫瘤生長(zhǎng)的指標(biāo)[2]，但正常人循環(huán)中也存在較低水平cf-DNA(平均10～15 ng/ml)，在組織應(yīng)激條件下可升高，包括運(yùn)動(dòng)、炎癥、組織損傷等[10]。

2 cf-DNA的分離和檢測(cè)

由于疾病源性cf-DNA水平低，半衰期短，需要對(duì)cf-DNA進(jìn)行專門的分離和檢測(cè)。目前主要的分離方法有：相分離法、基于硅膜的旋轉(zhuǎn)柱技術(shù)和基于磁珠的分級(jí)篩選法[11-12]。Campos等[13]提出了一種新型的微流控固相萃取裝置用于cf-DNA的分離，該方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)勢(shì)。目前檢測(cè)cf-DNA的方法主要有兩種，一種方法是靶向DNA測(cè)序技術(shù)，如數(shù)字PCR(dPCR)、液滴PCR(ddPCR)、巢式PCR(nested PCR)、實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)，深度測(cè)序以及靶向糾錯(cuò)測(cè)序等[14-16]；另一種檢測(cè)方法是非靶向第二代測(cè)序技術(shù)，如全基因測(cè)序、全外顯子組測(cè)序等[17]。

3 cf-DNA在肝癌中的應(yīng)用

精準(zhǔn)醫(yī)療在腫瘤學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵目標(biāo)是提高癌癥的診斷和治療水平[18]。在癌癥患者中，從腫瘤細(xì)胞中釋放出來的cf-DNA通常被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating free tumor DNA，ct-DNA)，ct-DNA在整個(gè)cf-DNA中的占比差異很大，從小于0.1%到大于90%不等[19]。由于腫瘤異質(zhì)性的存在穿刺組織活檢很難反映癌癥基因組全貌[20]，有證據(jù)[21]表明ct-DNA提供了較全腫瘤基因組信息，因?yàn)樗尸F(xiàn)了從多個(gè)腫瘤區(qū)域釋放入循環(huán)中的DNA或者來自不同腫瘤病灶的腫瘤相關(guān)循環(huán)DNA。總之，ct-DNA的這些特征使其在精準(zhǔn)腫瘤醫(yī)學(xué)應(yīng)用中成為有前景的分析物。

肝癌已成為中國(guó)人群過早死亡的第五大原因[22]。大多數(shù)肝癌患者就診時(shí)已進(jìn)展到中晚期，預(yù)后極差[23]。因此，開發(fā)精準(zhǔn)分子檢查工具至關(guān)重要。Xu等[24]通過比較肝癌組織和正常血液白細(xì)胞，確定了肝癌特異性甲基化標(biāo)記板，并發(fā)現(xiàn)肝癌相關(guān)基因和與之匹配的血漿ct-DNA的甲基化特征呈高度相關(guān)，且與腫瘤負(fù)擔(dān)、治療反應(yīng)和分期密切相關(guān)。該研究表明ct-DNA甲基化標(biāo)志物在肝癌的診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后中的實(shí)用性。近期Cai等[25]通過對(duì)cf-DNA中5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosines，5hmC)的全基因組定位，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證5hmC-Seal技術(shù)是一種高靈敏的表觀遺傳學(xué)工具，可用于早期肝癌的診斷。cf-DNA在肝癌中的應(yīng)用，因其非侵入、可靠的生物標(biāo)志物等特性，可以補(bǔ)充并最終取代侵襲性肝穿刺活檢，用于肝癌的診斷、分期、療效評(píng)價(jià)以及預(yù)后分析。同時(shí)，在疾病的早期發(fā)現(xiàn)肝癌，并行根治性切除，這對(duì)于提高患者的生存率至關(guān)重要。

4 cf-DNA在肝相關(guān)性寄生蟲病中的應(yīng)用

cf-DNA作為生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于肝相關(guān)性寄生蟲疾病的檢測(cè)是一個(gè)相對(duì)較新的概念，雖然cf-DNA檢測(cè)在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用沒有像在腫瘤學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速，但該方法可能對(duì)未來肝相關(guān)性寄生蟲病的診斷和控制具有重要作用。目前用于診斷寄生蟲病的方法中，宿主體液中檢測(cè)寄生蟲cf-DNA具有良好前景。迄今為止，cf-DNA已應(yīng)用于瘧疾[26]、阿米巴肝膿腫[27]、血吸蟲[28]以及肝棘球蚴[29]等累及肝寄生蟲疾病的檢測(cè)中。

4.1 瘧疾 瘧原蟲是導(dǎo)致瘧疾的病原體。盡管血液涂片的顯微鏡檢查仍然是瘧疾診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但使用PCR進(jìn)行分子檢測(cè)因其靈敏度和快速診斷性在瘧原蟲診斷中越來越受歡迎。在早期研究中，Gal等[26]首次報(bào)道瘧疾患者的血漿中存在瘧原蟲源性cf-DNA，共采集了10例瘧疾患者的血樣，其中6例瘧疾患者血液涂片鏡檢均為陽(yáng)性，血漿PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性。2例瘧疾患者顯微鏡檢查呈陰性，血漿PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性。2例瘧疾治愈的患者，顯微鏡檢查和血漿PCR檢測(cè)均為陰性，血漿中瘧原蟲源性cf-DNA的定量測(cè)定可能是診斷瘧疾和評(píng)價(jià)瘧疾預(yù)后的潛在指標(biāo)。研究[30]表明，利用PCR技術(shù)可在唾液和尿液中檢測(cè)到瘧原蟲源性cf-DNA。Ghayour等[31]采用巢式PCR技術(shù)，對(duì)惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的唾液、尿液和血液樣本進(jìn)行線粒體細(xì)胞色素B基因定位，結(jié)果顯示，巢床PCR對(duì)瘧原蟲混合種感染的診斷比血涂片顯微鏡檢更為敏感。唾液和尿液樣品的巢床PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，唾液樣品更準(zhǔn)確。因此，在需要重復(fù)取樣的瘧疾診斷中，唾液可以作為血液的替代品。

4.2 阿米巴肝膿腫 阿米巴肝膿腫是由于溶組織內(nèi)阿米巴突破黏膜屏障，經(jīng)門靜脈循環(huán)進(jìn)入肝臟引起的肝膿腫[32]。未及時(shí)診治的阿米巴肝膿腫是導(dǎo)致阿米巴患者死亡的主要因素。由于阿米巴肝膿腫與化膿性肝膿腫在血清學(xué)及影像學(xué)檢查較難鑒別，易導(dǎo)致病情延誤。Parija等[27]首次報(bào)道由于阿米巴肝膿腫患者的腎臟濾過屏障對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴DNA具有滲透性，通過PCR技術(shù)對(duì)疑似患者尿液檢測(cè)有助于阿米巴肝膿腫的診斷，也可為經(jīng)甲硝唑治療后阿米巴肝膿腫患者預(yù)后評(píng)估提供幫助。Haque等[33]研究表明，在阿米巴肝膿腫患者的血液、唾液及尿液中應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)到了溶組織內(nèi)阿米巴相關(guān)cf-DNA，但唾液和尿液檢出率優(yōu)于血液。cf-DNA檢測(cè)技術(shù)為阿米巴肝膿腫的診斷以及療效評(píng)價(jià)提供了新的方法。

4.3 血吸蟲病 cf-DNA作為診斷工具已用于血吸蟲患者的血漿、血清和其他體液(如唾液、尿液)的檢測(cè)[28,34]。檢測(cè)cf-DNA的臨床樣本獲取方便，克服了使用Kato-Katz方法收集糞便樣本和進(jìn)行顯微鏡檢查的實(shí)際困難和低精確度。因此，cf-DNA檢測(cè)經(jīng)常被用于血吸蟲病篩選的敏感項(xiàng)目[35]。最近的研究進(jìn)一步證明，與顯微鏡檢查相比，人糞便樣品定量PCR檢測(cè)可提高診斷準(zhǔn)確性。這種cf-DNA可能來源于成蟲或蟲卵。然而，尚不清楚成蟲DNA如何從循環(huán)中進(jìn)入腸道[36]。 實(shí)際上，與Kato-Katz檢測(cè)相比，血吸蟲相關(guān)cf-DNA檢測(cè)有更高的準(zhǔn)確性[37]。 此外，研究[38]表明,宿主血清檢測(cè)血吸蟲cf-DNA，在動(dòng)物模型感染的早期階段就可以進(jìn)行陽(yáng)性診斷。 使用cf-DNA檢測(cè)能發(fā)現(xiàn)早期感染，有利于早期治療，這將為血吸蟲患者的治療提供機(jī)會(huì)，而不會(huì)發(fā)展成慢性疾病。

4.4 肝棘球蚴病 肝棘球蚴病包括由細(xì)粒棘球蚴絳蟲感染引起的肝囊型包蟲病和多房棘球蚴絳蟲感染引起肝泡型包蟲病。目前，該病的診斷方法主要有影像學(xué)及血清學(xué)檢查，影像學(xué)檢查的挑戰(zhàn)在于對(duì)微小病灶(<2 cm)診斷存在困難，血清學(xué)檢測(cè)的局限是感染人群中有一部分患者無包蟲病陽(yáng)性血清學(xué)標(biāo)志物，cf-DNA用于棘球蚴病診斷有望提供新的途徑[29]。Chaya等[39]首次應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)囊液、血清和尿液中細(xì)粒棘球蚴特異性核酸用于囊型包蟲病的診斷，研究結(jié)果表明，PCR對(duì)棘球蚴囊液中細(xì)粒棘球蚴特異性DNA的檢測(cè)是高度敏感的，在囊型包蟲病囊泡破裂的患者血清中檢測(cè)同樣具有高度敏感性(可能與囊泡破裂特異性DNA進(jìn)入血液循環(huán)有關(guān))。Baraquin等[40]報(bào)道，首次確定在泡型包蟲病患者、泡型包蟲病動(dòng)物模型中存在cf-DNA。豐富了泡型包蟲病的分子學(xué)診斷方法，但由于該研究患者中檢測(cè)到的cf-DNA濃度極低，可能與樣本量、樣本提取以及樣本的性質(zhì)(該研究從血清中提取cf-DNA，腫瘤研究中多在血漿中提取)有關(guān)，此外關(guān)于特定的寄生序列是否優(yōu)先被釋放有待進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)

cf-DNA檢測(cè)技術(shù)在肝癌領(lǐng)域和肝相關(guān)性寄生蟲感染領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。但是，有效臨床應(yīng)用cf-DNA檢測(cè)技術(shù)需要準(zhǔn)確理解這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和局限性，同時(shí)也要標(biāo)準(zhǔn)化該技術(shù)的檢測(cè)方法，以便正確解釋結(jié)果，以指導(dǎo)臨床決策。此外，cf-DNA檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于肝相關(guān)性寄生蟲疾病診斷相對(duì)不成熟，還需要進(jìn)一步的改進(jìn)，特別是在改進(jìn)DNA提取方法的同時(shí)降低檢測(cè)成本，以及提高診斷準(zhǔn)確性和實(shí)用性。