李曉成：“非瘟”防控兩大關(guān)鍵技術(shù)之實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

在非洲豬瘟的整個(gè)防控工作當(dāng)中，不管是早期預(yù)警，早期發(fā)現(xiàn)，疑似病確診， 還是環(huán)境評(píng)估都離不開實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)， 尤其是隨著非洲豬瘟在我們國(guó)家的進(jìn)一步發(fā)展， 在臨床上， 非洲豬瘟的臨床癥狀多樣性越來(lái)越明顯， 我們通過(guò)臨床觀察很難確診疾病， 所以非瘟的診斷和防控都必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)， 對(duì)此我們需要對(duì)影響實(shí)驗(yàn)室診斷的一些因素必須有個(gè)清醒的認(rèn)識(shí)。

1 影響實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確檢測(cè)的因素

1.1 樣品的代表性

如果采的唾液樣本， 仍用生理鹽水和PBS 緩沖液， 會(huì)很難保證樣品的可靠性， 必須加一些有效的酶抑制劑， 才能有效保持唾液樣本的活性， 建議選用特定的保存液用于唾液樣品的采集及保存。

1.2 樣品的運(yùn)輸條件及保存時(shí)間

有人針對(duì)樣品的保存時(shí)間做過(guò)很多實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存7 天之內(nèi)進(jìn)行臨床檢測(cè)是比較有意義的。

1.3 樣品處理

在我們現(xiàn)有的已經(jīng)注冊(cè)和批準(zhǔn)使用的試劑盒當(dāng)中， 一般情況下不包含核酸提取試劑盒， 但是有人做過(guò)很多實(shí)驗(yàn)， 不同公司提供的核酸提取試劑盒差異非常大， 提取的質(zhì)量差異也很大， 即使是病毒含量很高的一些樣品， 最終結(jié)果也能出現(xiàn)一些差異性結(jié)果。

1.4 PCR 試劑盒

現(xiàn)階段使用最多的是熒光定量PCR 試劑盒， 但隨著非瘟的進(jìn)一步發(fā)展，防控能力不斷提升，越來(lái)越多的試劑盒會(huì)出現(xiàn)在我們大家的手中，如膠體金試劑盒、試紙條、免提試劑盒，還有其他一些試劑盒。 每一種試劑盒的使用范圍，樣品種類，靈敏度，最低檢測(cè)限等是不一致的。

所以我們一定要注意試劑盒的最低檢測(cè)限， 需要清楚知道我們使用試劑盒的檢測(cè)目的， 有目的性的選擇試劑盒。

1.5 實(shí)驗(yàn)室操作人員

實(shí)驗(yàn)室操作人員在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程當(dāng)中是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。 因?yàn)榉俏恋木壒剩?很多企業(yè)或者豬場(chǎng)新建了實(shí)驗(yàn)室， 有些實(shí)驗(yàn)室人員的素質(zhì)非常高， 但是有些實(shí)驗(yàn)室的人員素質(zhì)還是不盡如人意， 需要進(jìn)行培訓(xùn)。

1.6 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境是容易造成污染的， 所以說(shuō)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)該要想辦法盡可能去清除污染。

1.7 PCR 儀器

有一個(gè)大家以前沒(méi)有關(guān)注到的地方——PCR 儀器， 原先我們認(rèn)為所有的試劑盒， 所有的PCR 儀器都可以適應(yīng)。 但是經(jīng)過(guò)很多精細(xì)化的檢測(cè)壁壘實(shí)驗(yàn)以后， 有很多試劑盒對(duì)有些PCR 儀器是不適用的， 所以說(shuō)在PCR 儀器的選擇方面， 我們需要做一定的工作。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)一定要明確檢測(cè)目的

檢測(cè)目的會(huì)直接要求對(duì)樣品種類和混樣比例做出明確的規(guī)定

2.1 監(jiān)測(cè)預(yù)警

口腔和鼻腔拭子是首選樣品，且混樣比例不能過(guò)高， 一般規(guī)定不能超過(guò)10 個(gè)樣。

為什么？ 因?yàn)樨i在自然感染情況下，病毒最早出現(xiàn)在扁桃體，大概在3～6 天， 口腔和鼻腔出現(xiàn)這個(gè)病毒， 而且在早期口腔和鼻腔當(dāng)中的病毒含量不會(huì)太高， 所以為了提高靈敏度，提高準(zhǔn)確性，混樣比例不宜過(guò)高。

2.2 準(zhǔn)確診斷

口鼻拭子和抗凝血是最合適的樣本，樣本的混樣比例可以加大。

準(zhǔn)確診斷主要是用于臨床，當(dāng)臨床上出現(xiàn)臨床癥狀 （疑似病例）時(shí)，血液、口腔、鼻腔、組織當(dāng)中病毒含量極其高， 用哪一個(gè)組織哪一個(gè)樣本來(lái)檢測(cè)都沒(méi)有任何問(wèn)題了，而且有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)， 即使樣品稀釋到1∶2048，仍然能夠檢測(cè)到病原。

2.3 評(píng)估環(huán)境

環(huán)境評(píng)估判斷輿情風(fēng)險(xiǎn)或進(jìn)行復(fù)養(yǎng)最核心的一個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)。

在清洗和消毒之后環(huán)境樣品中的病毒含量一般都極低， 如果混樣比例高的話會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果， 建議一般情況下不主張超過(guò)10 個(gè)樣品的混合，一般是限定在10 個(gè)樣品以內(nèi)。

檢測(cè)目的可以決定提取試劑盒和PCR 試劑盒的選擇。

監(jiān)測(cè)預(yù)警及環(huán)境評(píng)估都要求核酸提取試劑盒、PCR 檢測(cè)試劑盒里的靈敏度要高， 而準(zhǔn)確診斷對(duì)試劑盒的選擇無(wú)需那么嚴(yán)格， 一般試劑盒基本上都能滿足要求， 比方說(shuō)一些靈敏度不高的試劑盒， 一些免提取的試劑盒， 我們直接做抗凝血的檢測(cè)，都沒(méi)有什么問(wèn)題。

可能最近一段時(shí)間， 有這樣一種現(xiàn)象，買PCR 儀器贈(zèng)送試劑盒， 有些甚至用很靈敏的一種發(fā)光試劑盒， 但這種試劑盒靈敏度很高，但是可靠性很差。 可靠性很差的最主要表現(xiàn)是什么？ 重復(fù)性很差，所以不主張用這種試劑盒， 建議首先選取已經(jīng)正式注冊(cè)， 有農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布文號(hào)的試劑盒。

3 檢測(cè)結(jié)果的解讀

試劑盒成立的條件是陰陽(yáng)性對(duì)照，必須出正確的結(jié)果。 檢測(cè)樣品出陽(yáng)性結(jié)果， 只能說(shuō)是核酸陽(yáng)性， 只代表病原的感染痕跡， 并不能說(shuō)明它具有感染性或者我們所說(shuō)的活性， 不能判斷病原的活性。 但是檢測(cè)核酸陰性結(jié)果， 最起碼能說(shuō)明我們對(duì)環(huán)境的清理、清洗、消毒起到了一定作用。 如果說(shuō)環(huán)境當(dāng)中仍然有核酸陽(yáng)性， 盡管我們不能判斷它是否有活性， 但是從另外一個(gè)方面反映，清理、清洗、消毒工作是不徹底的。