EGFR 在肺泡上皮不典型腺瘤樣增生中表達(dá)和突變的意義研究

（岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，湖南 岳陽 414000）

據(jù)報道，肺癌的發(fā)病率位居中國前10 位惡性腫瘤之首。盡管肺癌的治療已發(fā)展到手術(shù)、放療、化療以及分子靶向藥物等綜合治療階段，但預(yù)后仍然很差，患者的長期生存仍未得到明顯改善，其主要原因與肺癌的早期診斷較為困難，確診時往往已進入中晚期有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在肺癌中高表達(dá)并存在基因突變[1]，在肺泡上皮不典型腺瘤樣增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）也存在類似表現(xiàn)，而AAH 是肺癌特別是肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LAC）及其亞型細(xì)支氣管肺泡癌（Bronchioloalveolar carcinoma，BAC）的癌前病變甚至早期癌[2-5]。本研究旨在探討可否通過檢測AAH 中EGFR 的過表達(dá)和（或）其基因突變從而實現(xiàn)肺癌的早期診斷。

1 對象與方法

1.1 對象

收集中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院2006 年1 月-2010年6 月間經(jīng)病理確診為AAH 的病例，其中包括23 例單純AAH 病變病例和18 例癌旁肺泡上皮不典型增生病例。組織學(xué)上表現(xiàn)為低度AAH 的病例24 例，表現(xiàn)為高度AAH 的病例17 例。41 例病例中，男性21 例，女性20 例，男女比例為1.05∶1；患者年齡31-73 歲，中位年齡59 歲。在復(fù)習(xí)全部HE 切片并經(jīng)2 名副教授以上的病理科醫(yī)生確定診斷后，確定典型石蠟包埋組織塊。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化

采用免疫組織化學(xué)技術(shù)S-P 法（鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶連結(jié)法），進行EDTA 抗原熱修復(fù)和AEC 對比染色。

1.2.2 結(jié)果判斷和分析

EGFR、EGFR（E746-A750del Specific）、EGFR（L858R Mutant Spectific）的免疫組織化學(xué)染色陽性均呈淺棕色或棕紅色，表達(dá)在細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿。評分標(biāo)準(zhǔn)為：不顯色或顯色弱陽性且陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0 分；顯色弱陽性且陽性細(xì)胞數(shù)＞10%記1+；中度陽性記2+；強陽性記3+。本實驗出現(xiàn)1+、2+、3+即為EGFR、EGFR（E746-A750del Specific）、EGFR（L858R Mutant Spectific）染色陽性，0 分為陰性。以美國Cell Signaling（CST）公司提供的陽性對照片為陽性對照，PBS 溶液代替一抗作為陰性對照。

采用SPSS18 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用χ2檢驗，P ＜0.05 為差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。做相關(guān)性分析，r 值范圍－1～＋1，r=0 表示零相關(guān)，r ＜0 為負(fù)相關(guān)，越接近－1 負(fù)相關(guān)程度越高；r ＞0 為正相關(guān)，越接近＋1 正相關(guān)程度越高。（0＜|r|＜0.19 極低相關(guān)；0.20 ＜|r|＜0.39 低度相關(guān)；0.40 ＜|r|＜0.69 中度相關(guān)；0.70 ＜|r|＜0.89高度相關(guān)；0.90 ＜|r|＜0.10 極高相關(guān)）

2 結(jié)果

2.1 EGFR 蛋白陽性表達(dá)及其第19、21 號外顯子突變與不同程度AAH 的關(guān)系

2.1.1 EGFR 蛋白陽性表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

41 例病例中17 例高度AAH 的病例EGFR 蛋白全部表達(dá)為陽性，24 例低度AAH 病例中的只有17 例EGFR 蛋白表達(dá)陽性，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05，表1）。

表1 EGFR 蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

2.1.2 第19 號外顯子突變蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

17 例高度AAH 病例中有13 例出現(xiàn)第19號外顯子突變，表現(xiàn)為EGFR（E746-A750del Specific）突變蛋白表達(dá)陽性，24 例低度AAH 病例中的1 例第19 號外顯子突變，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05，表2）。

表2 第19 號外顯子突變蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

2.1.3 第21 號外顯子突變蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

17 例高度AAH 病例中有7 例第21 號外顯子突變，表現(xiàn)為EGFR（L858R Mutant Spectific）突變蛋白表達(dá)陽性，24 例低度AAH 病例中的2 例第21 號外顯子突變，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表3 第21 號外顯子突變蛋白表達(dá)與不同程度AAH 的關(guān)系

2.2 EGFR 基因第19、21 號外顯子突變與EGFR蛋白陽性表達(dá)的關(guān)系

2.2.1 EGFR 基因第19 號外顯子突變與EGFR 蛋白陽性表達(dá)的關(guān)系

EGFR 基因第19 號外顯子突變的AAH 患者EGFR 蛋白陽性表達(dá)率為100%，野生型的27 例AAH 患者中有20 例出現(xiàn)EGFR 蛋白陽性表達(dá)，陽性率為70.4%，AAH 患者EGFR 基因第19 號外顯子突變與EGFR 蛋白陽性表達(dá)呈低度正相關(guān)（r=0.3267，P＜0.05，表4）。

表4 EGFR 基因第19 號外顯子突變與EGFR 蛋白陽性表達(dá)的關(guān)系

2.2.2 EGFR 基因第21 號外顯子突變與EGFR 蛋白陽性表達(dá)的關(guān)系（表5）

EGFR 基因第21 號外顯子突變的AAH 患者EGFR 蛋白陽性表達(dá)率為100%，野生型的32 例AAH 患者中25 例EGFR 蛋白陽性表達(dá)，陽性率為75%，AAH 患者EGFR 第21 號外顯子突變與EGFR 蛋白陽性表達(dá)呈低度正相關(guān)（r=0.2406，P＜0.05，表5）。

表5 EGFR 基因第21 號外顯子突變與EGFR 蛋白陽性表達(dá)的關(guān)系

2.3 EGFR 蛋白陽性表達(dá)及其第19、21 號外顯子突變與AAH 患者性別、年齡的關(guān)系

2.3.1 EGFR 蛋白陽性表達(dá)與AAH 患者性別、年齡的關(guān)系

AAH 組織中EGFR 蛋白陽性表達(dá)率為82.9%（34/41）。男性組EGFR 蛋白陽性表達(dá)率為76.2%，女性組為90.0%，二組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表6）；年齡≤50 歲組、51-60 歲組、＞60 歲組EGFR 蛋白陽性表達(dá)率分別為70.0%、100%、77.8%，三組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表7）。

表6 AAH 組織中EGFR 蛋白陽性表達(dá)與AAH 患者性別的關(guān)系

表7 AAH 組織中EGFR 蛋白陽性表達(dá)與AAH 患者年齡的關(guān)系

2.3.2 EGFR 基因第19 號外顯子突變與AAH 患者性別、年齡的關(guān)系

41 例AAH 患者中，男性組EGFR 基因第19號外顯子突變率為33.3%，女性組為35.0%，二組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表8）；年齡≤50 歲組、51～60 歲組、＞60 歲組EGFR 基因第19 號外顯子突變率分別為20.0%、38.5%、38.9%，三組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表9）。

表8 EGFR 基因第19 號外顯子突變與AAH 患者性別的關(guān)系

表9 EGFR 基因第19 號外顯子突變與AAH 患者年齡的關(guān)系

2.3.3 EGFR 基因第21 號外顯子突變與AAH 患者性別、年齡的關(guān)系

41 例AAH 患者中，男性組EGFR 基因第21 號外顯子突變率為14.3%，女性組30.0%，二組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表10）；年齡≤50 歲組、51-60 歲組、＞60 歲組EGFR 基因第21 號外顯子突變率分別為10.0%、30.8%、22.2%，三組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表11）。

表10 EGFR 基因第21 號外顯子突變與AAH 患者性別的關(guān)系

表11 EGFR 基因第21 號外顯子突變與AAH 患者年齡的關(guān)系

2.4 癌旁肺泡上皮不典型增生與單純AAH 病變的比較

41 例AAH 患者中癌旁肺泡上皮不典型增生組有18 例，其中男性10 例，女性8 例，男女比例為1.25:1，平均年齡60.7 歲；單純AAH 病變的有23例，男性11例，女性12例，男女比例為1:1.09，平均年齡53.7 歲。癌旁肺泡上皮不典型增生與單純AAH 病變在EGFR 蛋白陽性表達(dá)上、EGFR 基因第19 號外顯子突變蛋白表達(dá)上及EGFR 基因第21 號外顯子突變蛋白表達(dá)上均有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表12）。

表12 癌旁肺泡上皮不典型增生患者與單純AAH 病變患者的比較

3 討論

EGFR是一種對細(xì)胞生長發(fā)育起重要作用的糖蛋白，但當(dāng)它異常表達(dá)時可造成細(xì)胞的過度增殖。大量的研究證實EGFR 和多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著相當(dāng)密切的關(guān)系，尤其是非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC 是肺癌的主要類型，其中LAC約占NSCLC 的1/3；而BAC 是LAC 亞型之一，約占NSCLC 的5%-25%[6]。有研究顯示，80%-90%的NSCLC 患者有EGFR 的過度表達(dá)，且突變率可高達(dá)42.6%，尤以LAC、BAC 中為高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織學(xué)類型[7]。本研究檢測了BAC 和LAC 的癌前病變（早期癌）AAH中EGFR蛋白呈陽性反應(yīng)，與既有的研究結(jié)果相一致；而AAH 根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點和異型性大小可分為高、低兩個級別，檢測結(jié)果顯示，高度AHH 中EGFR 蛋白的表達(dá)陽性率高于低度AAH。另外，EGFR 屬于受體型酪氨酸激酶，在其酪氨酸激酶區(qū)域附近的ATP 結(jié)合區(qū)域周圍是EGFR 突變的主要集中位置，其中第19 號外顯子及第21 號外顯子的突變是兩種最主要的突變形式，占所有突變覆蓋率的90%。有文獻(xiàn)報道，EGFR 基因在LAC 尤其是BAC 中有較高的突變率[8]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，AAH 中EGFR第19 號外顯子及第21 號外顯子存在突變，且高度AAH 中的突變率高于低度AAH。以上結(jié)果說明，AAH 從低度到高度的發(fā)展過程中EGFR 蛋白的陽性表達(dá)及其第19、21 號外顯子突變均呈遞增趨勢，提示EGFR 蛋白的過表達(dá)及其第19、21 號外顯子突變與AAH 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進一步分析AAH 中EGFR 基因第19 號和21 號外顯子突變與EGFR 蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果呈正相關(guān)，提示在AAH 到BAC 的發(fā)展過程中，EGFR 基因第19、21 號外顯子突變可能導(dǎo)致EGFR 蛋白的高表達(dá)。但是，AAH 中EGFR 蛋白表達(dá)及其第19、21 號外顯子突變與患者的性別及年齡無關(guān)。

AAH 作為癌前病變，特別是高度AAH 可發(fā)展為肺癌。研究報道，EGFR 在AAH 到浸潤性肺腺癌中均有陽性表達(dá)并呈遞增趨勢，被認(rèn)為在AAH 和肺腺癌的發(fā)展過程中起重要作用，可能促進AAH 發(fā)展到腺癌的過程。本研究發(fā)現(xiàn)，癌旁AAH 與單純AAH 中EGFR 蛋白陽性表達(dá)率、EGFR 基因第19 號外顯子和第21 號外顯子突變率存在顯著性差異，前者明顯高于后者，表明隨著AAH 病變的進一步發(fā)展，EGFR 蛋白的陽性表達(dá)及其第19、21 號外顯子突變也會呈遞增趨勢，與報道的結(jié)果表現(xiàn)一致。另有研究發(fā)現(xiàn)癌旁AAH患者（平均年齡為57.5 歲）男女比例無差別，而單純AAH 患者（平均年齡為44.5 歲）女性多發(fā)[9]。本研究中，癌旁AAH 患者與單純AAH 病變患者平均年齡都大于報道的研究結(jié)果，可能與所取樣本資料的差異有關(guān)；在性別比例上，癌旁AAH 患者男性略多于女性，而單純AAH 患者女性稍多于男性，但二者均相差不大。

綜上所述，檢測AAH中EGFR的過表達(dá)和（或）基因突變對BAC 和LAC 的早期診斷可能具有重要意義，為肺癌的早期診斷和治療提供理論依據(jù)，也為進一步研究肺癌的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。