替代對(duì)照品法測(cè)定復(fù)方甘草口服溶液中甘草苷和甘草酸含量

曾 芳，魏長(zhǎng)勇，余敏靈

（四川省樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山614099）

復(fù)方甘草口服溶液是由甘草流浸膏、愈創(chuàng)甘油醚、復(fù)方樟腦酊等制成的復(fù)方制劑，鎮(zhèn)咳祛痰功效良好。2015年版《中國(guó)藥典（二部）》中未對(duì)甘草苷含量進(jìn)行控制，本研究中以甘草酸銨為對(duì)照品采用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行甘草酸含量測(cè)定[1]。甘草酸銨易吸潮、價(jià)格貴，參考甘草、甘草流浸膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)[2-9]，以橙皮苷為對(duì)照品替代甘草苷、甘草酸銨，采用替代對(duì)照品法，以色譜峰保留時(shí)間為輔助，并采用紫外光譜特征和純度檢查因子作定性鑒別；在定量分析中，通過(guò)測(cè)定橙皮苷和被測(cè)定物質(zhì)的相對(duì)校正因子，并運(yùn)用校正因子計(jì)算甘草苷和甘草酸在制劑中的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（包括DAD檢測(cè)器，Open-LAB CDS工作站，美國(guó)Agilent公司）；PE-A10型高效液相色譜儀（包括DAD檢測(cè)器，珀金埃爾默公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（包括DAD檢測(cè)器，賽默飛世爾公司）；XSE205型電子天平（梅特勒-托利多公司，精度為十萬(wàn)分之一）；ULUP-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 試藥

甘草苷對(duì)照品（批號(hào)為111610-201607，含量為93.1%），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為110731-201720，含量為97.7%），橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110721-201818，含量為96.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘草酸單銨鹽A原料藥（批號(hào)為1707003，含量為67.2%，北京凱因科技股份有限公司）；復(fù)方甘草口服溶液（四川峨嵋山藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為20160701，20160702，20160703，20160704，20160705，20160706）；乙腈為色譜純，磷酸、甲醇、三乙胺均為分析純；復(fù)方樟腦酊、愈創(chuàng)甘油醚、甘油、濃氨溶液，均購(gòu)自四川峨嵋山藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取甘草苷對(duì)照品17.84 mg，置100 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解，并定容至100 mL，作為貯備溶液A；稱取橙皮苷對(duì)照品64.12 mg，置250 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至250 mL，作為貯備溶液B；稱取甘草酸銨對(duì)照品11.08 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解，并定容至10 mL，作為貯備溶液C。分別量取貯備溶液A和貯備溶液B各1.00 mL、貯備溶液C 2.00 mL，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶液，并定容至10 mL，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取樣品（批號(hào)為20160701）4mL，置50mL容量瓶中，加80%甲醇溶液，并定容至50 mL，即得。

樣品-橙皮苷混合溶液：另取樣品（批號(hào)為20160701）4 mL，置50 mL容量瓶中，加入貯備溶液B 5.00 mL，用80%甲醇定容至50 mL，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取復(fù)方樟腦酊18 mL、愈創(chuàng)甘油醚0.5 g、甘油12 mL、濃氨溶液適量，加水至100 mL，搖勻，作為陰性樣品溶液；取上述溶液4 mL，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇定容至50 mL，作為陰性對(duì)照品溶液；以80%甲醇作為空白溶液。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

提取混合對(duì)照品溶液和樣品-橙皮苷混合溶液色譜圖中甘草酸銨、甘草苷、橙皮苷色譜峰的紫外光譜圖，各組分在252 nm（甘草酸銨）、276 nm（甘草苷）、284 nm（橙皮苷）波長(zhǎng)處有最大吸收（見(jiàn)圖1），故選擇252，276，284 nm分別作為甘草酸銨、甘草苷、橙皮苷的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%三乙胺（A，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5），流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm（甘草酸銨）、276 nm（甘草苷）、284 nm（橙皮苷）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.4 方法學(xué)考察

圖1紫外光譜圖

表1流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）

專屬性試驗(yàn)：取2.1項(xiàng)下空白溶液、陰性對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、樣品-橙皮苷混合溶液各10μL，按擬訂色譜條件分別注入色譜儀中，測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。在284，276，252 nm為檢查波長(zhǎng)的色譜圖中，混合對(duì)照品溶液各組分主峰保留時(shí)間相同的位置上，樣品-橙皮苷混合溶液有相應(yīng)色譜峰，各色譜峰分離度均大于1.5；供試品溶液有與混合對(duì)照品溶液甘草酸銨和甘草苷保留時(shí)間一致的色譜峰，而無(wú)與混合對(duì)照品溶液橙皮苷保留時(shí)間一致的色譜峰；陰性對(duì)照品溶液和空白溶液均無(wú)在與混合溶液保留時(shí)間一致的色譜峰。與混合對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的樣品-橙皮苷混合溶液色譜圖中，甘草酸銨、甘草苷、橙皮苷紫外光譜最大吸收波長(zhǎng)分別為252，276，284 nm。樣品-橙皮苷混合溶液色譜圖中，匹配因子分別為甘草酸銨999.928/1 000，甘草苷999.911/1 000，橙皮苷999.954/1 000。

精密度試驗(yàn)：取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以每次甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷測(cè)定的峰面積計(jì)算。結(jié)果的RSD分別為0.35%，0.24%，0.31%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)為20160701）4 mL，依法制備供試品溶液共6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷峰面積的RSD分別為0.68%，0.22%，0.70%（n=6），表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下制備的供試品溶液10μL，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷峰面積的RSD分別為0.28%，0.33%，0.26%（n=7），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖2高效液相色譜圖

加樣回收試驗(yàn)：稱取甘草酸單銨鹽A（批號(hào)為1707003，含量為67.2%）334.82 mg，置100 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容至100 mL，作為甘草酸單銨鹽A貯備液；取樣品（批號(hào)為20160701，每1 mL樣品中含甘草苷0.162 8 mg、甘草酸銨2.893 1 mg）2 mL，置50 mL容量瓶中，精密加入貯備溶液A 2 mL、甘草酸單銨鹽A貯備液2 mL、貯備溶液B 5 mL，用80%甲醇定容至50 mL，得供試品溶液，平行制備6份。取10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，按Cm=（Am×Cs）/（f×As）計(jì)算，Cm（μg）為回收率供試品溶液中甘草酸銨或甘草苷進(jìn)樣量，Am為回收率供試品溶液中甘草酸銨或甘草苷的峰面積，Cs（μg）為回收率供試品溶液中橙皮苷進(jìn)樣量，Cs為回收率供試品溶液中橙皮苷峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 相對(duì)校正因子（f）值測(cè)定

取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2，5，10，15，20，25，30μL按擬訂色譜條件分別注入色譜儀，校正截距為0，以進(jìn)樣量（m，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以甘草酸銨和甘草苷曲線斜率分別除以橙皮苷曲線斜率計(jì)算f值，并以3臺(tái)不同液相色譜儀測(cè)定的平均值作為相對(duì)校正因子。結(jié)果甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷線性回歸方程分別為A=803.233 3m，A=1 786.872 0m，A=1 932.570 7m，r分別為0.999 3，0.999 2，0.999 5；線 性 范 圍 分 別 為0.443 0～6.495 1μg，0.049 3～0.740 2μg，0.033 2～0.498 3μg。甘草苷相對(duì)校正因子fA為1.081 4（RSD=0.25%，n=3），甘草酸銨相對(duì)校正因子fB為0.449 2（RSD=0.22%，n=3）。

2.6 相對(duì)校正因子耐受性與相對(duì)保留時(shí)間(tR)考察

取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，以3臺(tái)不同高效液相色譜儀、不同柱溫（31.0，30.0，29.0℃）、不同測(cè)定波長(zhǎng)（282/274/250 nm，283/275/251 nm，284/276/252 nm，285/277/253nm，286/278/254nm）、不同流動(dòng)相pH（2.9，2.7，2.5）、不同流速（1.005，1.000，0.995 mL/min）的條件進(jìn)行測(cè)定，按2.5項(xiàng)下方法計(jì)算f值，以及橙皮苷色譜峰分別與甘草苷色譜峰和甘草酸銨色譜峰保留時(shí)間的比值。結(jié)果見(jiàn)表3，表明不同液相色譜儀、柱溫流動(dòng)相pH、流速對(duì)tR無(wú)顯著影響。

2.7 紫外光譜穩(wěn)定性考察

取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.6項(xiàng)下方法（除測(cè)定波長(zhǎng)外）考察，提取橙皮苷、甘草酸銨、甘草苷紫外光譜圖。結(jié)果橙皮苷在（284±2）nm、甘草酸銨在（252±2）nm、甘草苷在（276±2）nm波長(zhǎng)處均有最大吸收；各成分紫外光譜圖與各自對(duì)照品建立的紫外圖庫(kù)相比較，匹配因子均大于999.9/1 000。

2.8 樣品含量測(cè)定

取樣品4 mL，按2.1項(xiàng)下方法制備樣品-橙皮苷混合溶液和供試品溶液。取樣品-橙皮苷混合溶液和供品試溶液10μL，按2.3項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并按回收試驗(yàn)項(xiàng)下公式計(jì)算甘草酸銨和甘草苷進(jìn)樣量，通過(guò)進(jìn)樣量計(jì)算樣品中甘草酸和甘草苷含量，測(cè)定結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)，與外標(biāo)法測(cè)定數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表2加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3甘草苷和甘草酸銨相對(duì)校正因子耐受性試驗(yàn)和相對(duì)保留時(shí)間考察結(jié)果

表4樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/mL）

3 討論

供試品溶液中定量加入替代對(duì)照品作為供試品溶液，替代對(duì)照品測(cè)定波長(zhǎng)按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的色譜條件，在未加入替代對(duì)照品的供試品溶液的色譜圖中，不應(yīng)有與替代對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰。

由于供試品溶液雜質(zhì)成分較多，對(duì)色譜柱有較高要求，未考察不同色譜柱相對(duì)保留時(shí)間的影響。參考國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH06492018，建議采用Welch Ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），本試驗(yàn)中采用以相對(duì)保留時(shí)間為輔助，各組分色譜峰提取紫外光譜圖和對(duì)照品色譜峰所建立的紫外純度檢測(cè)圖庫(kù)比較為主的定性方法。由于工作站所建立的圖庫(kù)只能應(yīng)用于同類色譜儀，故使用局限性較大。

替代對(duì)照品內(nèi)加入法不需要單獨(dú)制備與測(cè)定對(duì)照品溶液，可縮短試驗(yàn)時(shí)間，簡(jiǎn)化檢驗(yàn)程序。可同時(shí)進(jìn)樣測(cè)定待測(cè)組分和對(duì)照品，可降低儀器噪音和操作過(guò)程的影響，結(jié)果準(zhǔn)確，相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定。