小柴胡顆粒薄層鑒別方法研究*

馮文明，沙煒，周丹丹

（鑒甄檢測技術(shù)＜上海＞有限公司，上海200131）

小柴胡顆粒源自東漢張仲景《傷寒雜病論》記載的經(jīng)典名方小柴胡湯，為和解劑之祖方，由黨參（原方為人參）、柴胡、黃芩、姜半夏、生姜、大棗、甘草7味中藥組方，具有解表散熱、疏肝和胃之功效，主要用于外感病、邪犯少陽證等。目前，小柴胡顆粒執(zhí)行2015年版《中國藥典（一部）》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]，涉及柴胡、黃芩和甘草3個獨立的薄層色譜鑒別，操作復(fù)雜、耗時、低效、高成本。本研究中在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)和現(xiàn)有文獻[2-3]基礎(chǔ)上，建立了“一板多藥”的鑒別方法，可同時對小柴胡顆粒中柴胡（君藥）、黃芩（臣藥）和甘草（佐使藥）3味藥材進行薄層色譜鑒別，操作簡單快速，專屬性強，耐用性好，進一步完善了小柴胡顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ATS4型薄層色譜自動點樣儀，Visualizer 2型薄層色譜成像系統(tǒng)，均購自瑞士卡瑪公司；TH-Ⅱ型薄層加熱器（上海科哲生化科技有限公司）；KBF（E5.3）型恒溫恒濕箱（德國賓得公司）；XSE105DU型電子天平（梅特勒-托利多＜上海＞有限公司，精度為十萬分之一）；QUINTIX2102-1CN型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司，精度為百分之一）；P120H型超聲波清洗儀（德國Elma公司，功率為1 130 W，頻率為50/60 kHz）；TW20型恒溫水浴鍋（德國優(yōu)萊博公司）；ST-40R型高速冷凍離心機、ST-40型高速離心機（賽默飛世爾科技公司）；A10型超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）。

1.2 試藥

柴胡對照藥材（批號為120992-201509），黃芩對照藥材（批號為120955-201810），甘草苷對照品（批號為111610-201908），均購自中國食品藥品檢定研究院；柴胡皂苷b2對照品（批號為Z04S9L69482，上海源葉生物科技有限公司）；柴胡皂苷H對照品（批號為DST191009-014，成都德思特生物技術(shù)有限公司）；小柴胡顆粒（規(guī)格為每袋10 g，批號分別為k90106，k90108，k90116，k90117，k90125，k90141，k90143，k90148，k90150，k90155，k90156，k90157，k90158，k90159，k90162）；柴胡藥材、黃芩藥材、甘草藥材、柴胡陰性制劑、黃芩陰性制劑、甘草陰性制劑，均購自廣州白云山光華制藥股份有限公司，由本公司孟千萬講師鑒定為正品。HSGF254型薄層色譜硅膠預(yù)制板（煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所，銀龍板，批號為20190912）；HPTLC Silica gel 60 F254（1.05642）型Merck板（德國Merk公司，批號為HX87113742）；HPTLC-Fertigplatten Nano-SIL-20 UV254（811023）型MN板（德 國MN公 司，批 號 為309259）；其余試劑均為分析純，購自上海泰坦科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 溶液制備

取樣品2 g，加15 mL水，超聲處理（功率為330 W，頻率為37 kHz）使溶解，用水飽和正丁醇萃取2次，每次15mL，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液10mL洗滌，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL，溶解，作為供試品溶液。

取柴胡對照藥材0.5 g，加入30 mL水，加熱回流1.5 h，放冷，濾過，濾液自“用水飽和正丁醇萃取2次”起同法制備柴胡對照藥材溶液。

取黃芩對照藥材0.1 g，加4 mL甲醇，超聲20 min，離心，取上清液，作為黃芩對照藥材溶液。

取甘草苷對照品、柴胡皂苷b2對照品、柴胡皂苷H對照品適量，分別加入甲醇制成每1 mL含0.1 mg甘草苷、0.5 mg柴胡皂苷b2、0.2 mg柴胡皂苷H的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 “一板多藥”定性鑒別

照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述對照品溶液和供試品溶液5～10μL，對照藥材溶液1～2μL，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，使其成條帶狀（8 mm），以乙酸乙酯-丙酮-無水甲酸-水（7∶1∶1∶1，V/V/V/V）為展開劑，展開缸濾紙飽和20 min，展距6 cm，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液，在105℃加熱3～4 min，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與柴胡皂苷b2、柴胡皂苷H對照品、柴胡對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同棕紅色熒光斑點；在與黃芩對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同的藍色熒光斑點；在與甘草苷對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的黃色熒光斑點。

2.2 結(jié)果

2.2.1 專屬性考察[4]

分別取陰性制劑2 g，按供試品溶液制備方法制備陰性制劑溶液并點樣，色譜圖見圖1。結(jié)果在與柴胡皂苷b2、柴胡皂苷H對照品、柴胡對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液（批號為k90108，k90116，k90125）顯相同的棕色熒光斑點；在與黃芩對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的藍色熒光斑點；在與甘草苷對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的黃色熒光斑點，且陰性制劑均無干擾，表明此方法專屬性強。

2.2.2 耐用性考察[4]

考察不同廠家的高效硅膠板（Merck板，MN板和銀龍板）、不同展開溫度（10，20，30℃）和不同展開相對濕度（30%，50%，70%）對其薄層色譜行為的影響。結(jié)果見圖2。可見，上述因素對小柴胡顆粒的薄層色譜行為影響較小，本方法斑點清晰，耐用性良好。

圖1專屬性試驗薄層色譜圖

2.3 樣品檢測

另取12批樣品驗證方法的適用性。結(jié)果見圖3，供試品溶液色譜中，在與柴胡皂苷b2對照品、柴胡皂苷H對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的棕紅色熒光斑點；在與黃芩對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的藍色熒光斑點；在與甘草苷對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的黃色熒光斑點。對照品甘草苷Rf=0.66，柴胡皂苷b2Rf=0.42，柴胡皂苷HRf=0.31，黃芩鑒別點Rf=0.26。

3 討論

薄層色譜法操作簡單靈活，專屬性強，可快速有效地鑒定真?zhèn)危谥兴幏治鲱I(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5-6]，美國藥典（USP）和歐洲藥典（EP）均推薦用于天然藥物的鑒別。

2015年版《中國藥典（一部）》小柴胡顆粒標(biāo)準(zhǔn)中，需要進行3次薄層色譜鑒別。柴胡鑒別的供試品溶液需通過聚酰胺柱進行制備；甘草對照藥材需用水煎煮提取；黃芩鑒別需調(diào)節(jié)pH、萃取等。操作煩瑣、耗時，檢測效率低，成本高。因此，有必要提升和優(yōu)化小柴胡顆粒的鑒別方法。

柴胡為方中君藥，其中皂苷類成分以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為主，柴胡經(jīng)煎煮后，兩者會轉(zhuǎn)換成柴胡皂苷b1和b2[7-8]。第17版《日本藥典》（日本藥局方）中小柴胡湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[9]分別以柴胡皂苷b2和甘草苷對照品為對照對柴胡和甘草進行鑒別。采用模擬制劑生產(chǎn)工藝的方法，對柴胡藥材和甘草藥材加熱回流提取后，按供試品溶液制備方法制備。其中，柴胡藥材有2個特征斑點（Rf=0.42，0.30）傳遞到制劑中，分別為柴胡皂苷b2和柴胡皂苷H。前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草藥材中有1個特征斑點（甘草苷，Rf=0.64）傳遞到制劑中。考慮到柴胡皂苷H對照品不易購買，且價格昂貴，可選擇以柴胡皂苷b2和柴胡對照藥材為參照，對小柴胡顆粒中的柴胡進行鑒別。

圖2耐用性試驗薄層色譜圖

圖3樣品檢測薄層色譜圖

2015年版《中國藥典（一部）》標(biāo)準(zhǔn)中僅使用黃芩苷鑒別黃芩。本方法中檢測出了一個具有黃芩專屬性的特征斑點（Rf=0.24），可豐富黃芪藥材鑒定信息。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甲醇超聲處理后就能提取出黃芩藥材的特征斑點，最終確定黃芩對照藥材以超聲處理方式制備。

黨參炔苷為黨參的主要有效成分，曾考察2015年版《中國藥典（一部）》中小柴胡膠囊和小柴胡泡騰片[1]項下黨參的TLC鑒別方法。研究發(fā)現(xiàn)，供試品溶液與陰性制劑的薄層色譜行為完全一致，故藥典方法無法實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。同時，采用不同的展開體系仍未檢出黨參炔苷。液相色譜法分析結(jié)果顯示，小柴胡顆粒中黨參炔苷的含量非常低，無法作為TLC的特征成分進行鑒別。6-姜辣素為生姜的主要有效成分，但在制劑中未檢出6-姜辣素，且液相色譜結(jié)果佐證此結(jié)果。推測可能是，在濃縮過程中6-姜辣素等芳香性成分受到了損失。半夏主要成分是淀粉，少量氨基酸和其他小極性成分，在制劑中未檢出氨基酸色譜條帶。大棗主要成分是多糖及三萜類成分（如齊墩果酸和白樺脂酸等），嘗試以齊墩果酸和白樺脂酸為對照，均未檢出相應(yīng)條帶。因此，下階段的工作重點是建立黨參、生姜、半夏、大棗的薄層色譜鑒別方法。

對“一板多藥”鑒別方法展開劑的考察，確定乙酸乙酯-丙酮-無水甲酸-水（7∶1∶1∶1，V/V/V/V）、乙酸乙酯-丙酮-無水甲酸-水（5∶2∶1∶1，V/V/V/V）、乙酸乙酯-正丁醇-無水甲酸-水（5∶2∶1∶1，V/V/V/V）3個展開系統(tǒng)。通過考察不同展開劑對供試品溶液的色譜條帶成點性、分離度及Rf值的影響，確定最佳展開系統(tǒng)。結(jié)果表明，3個展開系統(tǒng)均能在與柴胡皂苷b2對照品溶液、柴胡皂苷H對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的棕紅色熒光斑點；在與黃芩對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的藍色熒光斑點；在與甘草苷對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的黃色熒光斑點。展開劑為乙酸乙酯-丙酮-無水甲酸-水供試品溶液色譜有條帶重疊，且整體Rf值較高；展開劑為乙酸乙酯-正丁醇-無水甲酸-水，各條帶雖分離相對較好，但展開系統(tǒng)中含有正丁醇，氣味較大，且有神經(jīng)毒性；展開劑為乙酸乙酯-丙酮-無水甲酸-水時，各條帶分離度好，整體Rf較合理。故選擇乙酸乙酯-丙酮-無水甲酸-水作為“一板多藥”鑒別的展開系統(tǒng)。

綜上所述，所建立的“一板多藥”鑒別方法，簡單、高效，專屬性強，可同時定性鑒別小柴胡顆粒中的柴胡、黃芩、甘草，完善和提升了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。