超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定夏枯草中4種酚酸含量*

柏玉冰，李洪權(quán)，包 敏△，林 艷

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007；2.湖南省株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲412000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208）

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，具清火、明目、消腫、散結(jié)等功效，常用于治療目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰、乳癖、乳房脹痛等病癥[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，夏枯草具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老等作用[2]，酚酸類成分為其主要功效成分[3-5]。為此，多項(xiàng)研究基于酚酸類成分建立夏枯草的質(zhì)量控制方法[6-7]，且這些質(zhì)量評(píng)定均基于可高效、準(zhǔn)確地測(cè)定夏枯草中酚酸類成分的含量。酚酸類成分包括阿魏酸[8-9]、迷迭香酸[6，9-13]、異迷迭香酸苷[6，10-12]、咖啡酸[6，9，11，13]、原兒茶酸[6，9]、原兒茶醛[6]、水楊酸[8]、間羥基苯甲酸[8]、對(duì)羥基苯甲酸[8]、對(duì)香豆酸[8]、丁香酸[8]、肉桂酸[8]、芥子酸、3-咖啡酰奎尼酸[8]和綠原酸[9]。但原兒茶酸和原兒茶醛響應(yīng)值相對(duì)較小，不利于準(zhǔn)確定量[6]；阿魏酸與其他極性相似成分有重疊峰，定量準(zhǔn)確性較差[8]；綠原酸在甲醇提取液中未檢出，與其他相關(guān)報(bào)道相矛盾[9]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些含量測(cè)定研究均基于高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)（HPLCDAD）法而建立。因此，可推測(cè)這些問(wèn)題的產(chǎn)生應(yīng)為HPLC-DAD法對(duì)分離度高度依賴、檢測(cè)物質(zhì)含量需要達(dá)到微克級(jí)、檢測(cè)物質(zhì)需產(chǎn)生一定強(qiáng)度的紫外吸收等[14]。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法由于其根據(jù)質(zhì)荷比差異而區(qū)分，且測(cè)定低限可達(dá)納克級(jí)等優(yōu)勢(shì)，故可克服上述問(wèn)題[15-16]。本研究中建立了測(cè)定夏枯草中原兒茶酸、原兒茶醛、阿魏酸和綠原酸的4種酚酸類成分含量的UPLC-MS/MS法，以期快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)夏枯草中酚酸類成分的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 InfinityⅡ型超高效液相色譜儀（1 mV，1～1 000 mV，安捷倫科技有限公司）；XSE 205DV型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為0.01 mg）；QTRAP 4500型三重四極桿質(zhì)譜（質(zhì)量范圍為0.10 amu，50～1 650 amu，上海愛(ài)博才思分析儀器有限公司）；HNS-SY-150型超聲波儀（北京恒奧德儀器儀表有限公司，功率為400 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

夏枯草（果穗，市售），樣品信息見(jiàn)表1。經(jīng)湖南省株洲市食品藥品檢驗(yàn)所包敏主管藥師鑒定為正品。樣本存放于株洲市食品藥品檢驗(yàn)所中藥材樣品室，藥材均經(jīng)粉碎后過(guò)四號(hào)篩，備用。綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753-201716，規(guī)格為20 mg，純度為99.3%），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為110773-201614，規(guī)格為50 mg，純度為99.0%），原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)為110809-201205，規(guī)格為20 mg，純度為99.9%），原兒茶醛對(duì)照品（批號(hào)為110810-201007，規(guī)格為20 mg，純度為98.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（4 L，純度為99.99%，批 號(hào) 為AH015-4HC），甲 醇（4 L，純 度 為99.99%，批號(hào)為AH230-4HC），均購(gòu)自霍尼韋爾有限公司。

表1夏枯草藥材樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Welch Xtimate C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～6 min時(shí)90%A→10%A，6～8 min時(shí)10%A，8～8.5 min時(shí)10%A→90%A，8.5～10.0 min時(shí)90%A）；流速：0.5 mL/min；采集時(shí)間：10 min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜：電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度：550℃；電噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣：35.0 psi；離子源氣1：55 psi；離子源氣2：55 psi；碰撞氣：氬氣。各成分的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 4種酚酸類成分的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，即得，各對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為0.196，0.225，0.223，0.278 mg/mL。

供試品溶液：取夏枯草粉末（粉碎后過(guò)四號(hào)篩），取細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液30 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率為400 W，頻率為40 kHz）提取40 min，靜置至室溫，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。提取2次，合并提取液。精密量取1 mL置10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

空白對(duì)照品溶液：不加入夏枯草粉末樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取2.2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果空白對(duì)照品溶液色譜圖中，與4種待測(cè)成分對(duì)應(yīng)色譜峰位置均無(wú)雜質(zhì)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察與定量限（LOQ）測(cè)定：精密量取混合對(duì)照品溶液適量，用50%甲醇溶液稀釋得系列質(zhì)量濃度的溶液（綠原酸0.019 6，0.098，0.392，1.568，1.96，2.94μg/mL；阿魏酸0.022 5，0.112，0.45，1.8，2.25，3.375μg/mL；原兒茶酸0.022 3，0.112，0.446，1.784，2.23，3.345μg/mL；原兒茶醛0.027 8，0.139，0.556，2.224，2.78，4.17μg/mL）。按擬訂色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度（C，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并以信噪比（S/N）為10時(shí)測(cè)得的各成分的量作為L(zhǎng)OQ。結(jié)果見(jiàn)表3，表明4種成分在各自線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，按擬訂色譜-質(zhì)譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD分別為0.71%，0.64%，0.87%，0.92%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為SP20181021）樣品，稱取6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為674.39，119.75，602.06，280.35μg/g，RSD分 別 為1.52%，1.40%，1.17%，1.29%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

圖1高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖

表3 4種成分線性關(guān)系及定量限檢測(cè)結(jié)果（n=6）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為SP181201）樣品供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為2.01%，1.85%，1.69%，2.31%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為SP181201）6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入絕對(duì)含量接近0.25 g藥材所含的對(duì)照品，依法分別制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 樣品含量測(cè)定

取6批樣品，各2份，精密稱定，依法分別制備供試品溶液，按擬訂色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，帶入線性回歸方程計(jì)算4種成分的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件優(yōu)化

提取溶劑：比較了不同提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、100%甲醇）的提取效果，以4種成分的峰面積大小為判斷依據(jù)，確定最佳提取溶劑。結(jié)果當(dāng)甲醇濃度為50%時(shí)，4種酚酸類成分的峰面積均達(dá)到最大值，故以50%甲醇為最佳。

表4夏枯草中4種成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表5 6批次樣品的4種酚酸類成分的含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=2）

提取時(shí)間：比較了不同提取時(shí)間（10，20，30，40，50 min）的提取效果，以4種成分的峰面積不再增加為判斷依據(jù)，確定最佳提取時(shí)間。結(jié)果4種成分均在提取40 min時(shí)達(dá)到最大值，故以40 min為最佳。

提取體積：比較了不同提取體積（10，20，30，40，50 mL）的提取效果，以4種成分的絕對(duì)含量最大為判斷依據(jù)，確定最佳提取體積。結(jié)果提取體積為30 mL時(shí)，其峰面積的絕對(duì)值達(dá)到上限，故以30 mL為最佳。

提取次數(shù)：比較了不同提取次數(shù)（1，2，3，4，5次）的提取效果，以4種成分的峰面積為判斷依據(jù)，確定最佳提取次數(shù)。結(jié)果第2次提取時(shí)，4種成分的峰面積已占5次峰面積總和的95%以上，故以2次為最佳。

3.2 色譜條件優(yōu)化

色譜柱：比較了3款不同的色譜柱，包括Agela Venusil AS-TC18柱，Welch Xtimate C18柱，Acclaim 120 C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），以4種成分的分子離子峰的保留性和峰形為判斷依據(jù)。結(jié)果使用Agela Venusil AS-TC18柱時(shí)，出峰時(shí)間較快，4種成分均在3 min內(nèi)全部出峰，但4種成分均有拖尾現(xiàn)象，尤其是原兒茶醛和綠原酸；當(dāng)使用Acclaim 120 C18柱時(shí)，出峰時(shí)間為5～7 min，但4種成分均有嚴(yán)重拖尾，尤其是原兒茶醛；而當(dāng)使用Welch Xtimate C18色譜柱時(shí)，出峰時(shí)間為5～7 min，出峰時(shí)間較Agela Venusil AS-TC18柱晚，但峰形均較好，故Welch Xtimate C18柱為合適色譜柱。

流動(dòng)相：比較了2種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含5 mmol/L的乙酸銨0.1%甲酸水溶液），以4種成分的峰面積大小為判斷依據(jù)。結(jié)果，隨著乙酸銨的加入，4種成分的峰面積均縮小，表明乙酸銨對(duì)酚酸類成分的離子化具有抑制作用，故乙腈-0.1%甲酸水溶液為合適流動(dòng)相系統(tǒng)。

流速和進(jìn)樣體積：比較了不同的流速（0.4，0.5，0.6 mL/min），以4種成分的峰形為判斷依據(jù)。發(fā)現(xiàn)不同流速情況下出峰時(shí)間相差不大，且峰型均較好，故推測(cè)小范圍內(nèi)不同流速對(duì)于峰形并無(wú)明顯影響。同樣的條件下考察了不同的進(jìn)樣體積（1，2，3μL），以4種成分的峰形為判斷依據(jù)。與不同流速情況類似，不同流速對(duì)于峰形無(wú)明顯影響。故選擇0.5 mL/min和2μL為本次的試驗(yàn)條件。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中首次建立了夏枯草中綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸和原兒茶醛4種酚酸類成分的UPLC-MS/MS法，可同時(shí)簡(jiǎn)單、快速和高效地得出夏枯草中多種酚酸類成分的含量，為進(jìn)一步研究夏枯草酚酸類成分的量效關(guān)系、質(zhì)量控制等奠定了基礎(chǔ)。