羅漢松種子總黃酮含量測(cè)定*

劉欣宇，呂玉媛，林樂(lè)珍，黃增瓊

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530021）

羅漢松實(shí)為羅漢松科羅漢松屬植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don或短葉羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.maki（Sieb.）Endl.的果實(shí)，由種子和花托組成，具有補(bǔ)腎益肺、大補(bǔ)元?dú)夤πВ糜谥委熜奈竿春脱摗⒚嫔S[1]。羅漢松實(shí)含有多糖[2]、川芎嗪、石竹烯等化學(xué)成分[3]；羅漢松莖、枝葉中含有豐富的黃酮類化合物[4-5]和萜類化合物[6-7]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羅漢松提取物具有保護(hù)心臟、抑制胃癌細(xì)胞、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化及保護(hù)肝臟作用[8-11]，可能與其所含黃酮類成分有關(guān)。目前，關(guān)于羅漢松種子中總黃酮含量測(cè)定方法的研究報(bào)道較少，尚無(wú)法確定其總黃酮的含量。本研究中采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定羅漢松種子中總黃酮含量，可為今后羅漢松實(shí)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及藥理活性研究提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

萬(wàn)能粉碎機(jī)（無(wú)錫久平儀器有限公司）；XS-205DU型天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；CD-UPH-Ⅱ-20T型超純水器（成都超純科技有限公司）；TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

羅漢松種子采自廣西北海，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李瓊講師鑒定為正品，符合藥典規(guī)定；蘆丁對(duì)照品（成都麥德生科技有限公司，批號(hào)為RP190213）；氫氧化鈉（天津市光復(fù)發(fā)展科技有限公司，分析純）；亞硝酸鈉（天津博迪化工股份有限公司，分析純）；硝酸鋁（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)為20180502）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

對(duì)照品溶液：取蘆丁對(duì)照品50 mg，精密稱定，置燒杯內(nèi)，加入30 mL 70%乙醇，超聲溶解（功率為500 W，頻率為40 kHz），轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，以70%乙醇定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.951 4 mg/mL的蘆丁貯備液，置4℃冰箱中保存，備用。取蘆丁對(duì)照品20mg，精密稱定，置燒杯內(nèi)，加入40 mL 70%乙醇，超聲溶解（功率為500 W，頻率為40 kHz），轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以70%乙醇定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.199 8 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，置4℃冰箱保存，備用。

供試品溶液：取羅漢松種子粗粉200 g，置圓底燒瓶中，加入6倍量70%乙醇，回流提取1 h，過(guò)濾，收集濾液；濾渣重復(fù)提取1次，合并2次提取液，減壓濃縮，80℃烘干，得羅漢松種子乙醇提取物干膏，備用。稱取羅漢松種子乙醇提取物干膏50 mg，置燒杯中，加入40 mL 70%乙醇，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）30 min，溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以70%乙醇定容，搖勻，即得，置4℃冰箱保存。

空白對(duì)照溶液：量取70%乙醇置25 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.2 顯色方法

取對(duì)照品溶液、空白對(duì)照溶液和供試品溶液各適量，置25 mL容量瓶中，精密加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，最后加入4% NaOH溶液5 mL，以70%乙醇溶液定容，搖勻，靜置15 min顯色。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.2 mL、供試品溶液和空白對(duì)照溶液各0.3 mL，按2.2項(xiàng)下方法顯色，以空白對(duì)照溶液調(diào)零，于190～700 nm波長(zhǎng)范圍分別掃描對(duì)照品溶液和供試品溶液。結(jié)果，兩者于253 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為253 nm。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取質(zhì)量濃度為0.199 8 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液0.08，0.10，0.14，0.18，0.22 mL，分別置25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為0.639，0.799，1.119，1.439，1.758μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按2.2項(xiàng)下方法顯色。以顯色后的空白對(duì)照溶液調(diào)零，于253 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0.904 4X+1.073 3，r=0.997 3。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在0.639～1.758μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為0.799μg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，以顯色后的空白對(duì)照溶液調(diào)零，重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果總黃酮吸光度的RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取提取物干膏樣品50 mg，共6份，精密稱定，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取0.1 mL，按2.2項(xiàng)下方法顯色，以顯色后的空白對(duì)照溶液調(diào)零，測(cè)定供試品溶液的吸光度。結(jié)果總黃酮平均含量為335.12 mg/g，RSD為1.20%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取0.1 mL已知含量的供試品溶液，按2.2項(xiàng)下方法顯色，室溫放置，以顯色后的空白對(duì)照溶液調(diào)零，測(cè)定供試品溶液在15，30，45，60 min時(shí)的吸光度。結(jié)果60，45，30 min內(nèi)溶液吸光度值的RSD分別為5.05%，4.22%，0.75%（n=3），表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取提取物干膏（批號(hào)為20180702）25 mg，共6份，精密稱定，分別加入質(zhì)量濃度為0.951 4 mg/mL的蘆丁貯備液8 mL，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液。各取0.1 mL供試品溶液，按2.2項(xiàng)下方法顯色。以顯色后的空白對(duì)照溶液調(diào)零，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 樣品含量測(cè)定

取同批提取物干膏（批號(hào)為20180702）50 mg，共3份，精密稱定，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取0.1 mL，按2.2項(xiàng)下方法顯色。以顯色后的空白對(duì)照溶液調(diào)零，測(cè)定吸光度。結(jié)果黃酮平均含量為323.50mg/g，按干膏提取率14.42%計(jì)算，羅漢松種子中總黃酮含量為4.66%。

表1總黃酮加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 討論

3.1 提取方法選擇

采用回流提取法提取羅漢松種子中的總黃酮，與超聲提取法[12]相比，其對(duì)樣品粒徑?jīng)]有嚴(yán)格要求，對(duì)儀器設(shè)備的要求相對(duì)較低，可用于大規(guī)模提取。提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等均會(huì)對(duì)黃酮類化合物的提取效果產(chǎn)生影響[13]，后續(xù)可通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳提取工藝條件。

3.2 試驗(yàn)條件選擇

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法可使黃酮類化合物開(kāi)環(huán)生成查耳酮而顯色[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，顯色劑的用量和加入試劑后的放置時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果存在較大影響。因此，應(yīng)控制好顯色劑用量，并嚴(yán)格控制顯色時(shí)間。經(jīng)NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色后，蘆丁在510 nm波長(zhǎng)附近有最大吸收[15]。本研究中，經(jīng)紫外掃描發(fā)現(xiàn)，蘆丁對(duì)照品和提取物乙醇溶液均在253 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，而在510 nm波長(zhǎng)附近無(wú)吸收峰。因此，選擇253 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品溶液室溫放置45 min后，穩(wěn)定性較差，可能與加入氫氧化鈉后反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和顏色發(fā)生改變有關(guān)。經(jīng)測(cè)定，供試品溶液室溫放置30 min穩(wěn)定性較好，故采用該方法測(cè)定羅漢松種子中總黃酮含量時(shí)，樣品溶液配制后需在30 min內(nèi)完成。

3.3 方法評(píng)價(jià)

羅漢松種子揮發(fā)油中的川芎嗪可能是羅漢松實(shí)具有治心胃痛功效的主要原因。本研究結(jié)果顯示，羅漢松種子中總黃酮含量較高（4.66%），具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。大量研究顯示，黃酮類化合物具有抗氧化、調(diào)血脂、改善心肌供血、抗腫瘤、抗糖尿病、抗病毒等藥理作用[16-19]。推測(cè)羅漢松實(shí)治心胃痛的功效還可能與其中所含的黃酮類成分有關(guān)。本方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性良好，準(zhǔn)確性較高，可作為羅漢松種子總黃酮的含量測(cè)定方法，也可為羅漢松實(shí)藥材質(zhì)量控制及相關(guān)藥理學(xué)研究提供參考。