不同促滲劑對右旋酮洛芬氨丁三醇水凝膠貼劑透皮吸收的影響

陳永順，楊金霞，王啟斌

（湖北省十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬太和醫院，湖北 十堰442000）

右旋酮洛芬氨丁三醇（DKT）是具有苯丙酸結構的非甾體抗炎藥，具有抗炎、抗風濕和鎮痛藥理活性[1-2]。但其半衰期較短，有效血藥濃度維持時間有限，對胃腸道刺激性較大。水凝膠貼劑具有無刺激性、載藥量大、透皮效果好、生物利用度高及透氣性好等優點[3]。將DKT制成水凝膠貼劑，可發揮長效鎮痛作用，減少胃腸道不良反應。皮膚的屏障作用限制了大多數藥物的有效吸收，故在貼劑的處方中會添加合適的促滲劑，以促進藥物的透皮吸收。目前，常用促滲劑有尿素、油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮等。在前期試驗[4]的基礎上，本研究中采用體外透皮吸收法，考察一元促滲劑及多元促滲劑對DKT水凝膠貼劑的促滲作用，以優選促滲劑；同時研究了DKT水凝膠貼劑（無促滲劑組和含促滲劑組）在比格犬體內的藥代動力學，考察其體內促滲效果。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

Waters 600型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；改良Franz擴散池（自制）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，精度為0.000 1 g）；TGL-16BG型臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；SK-1型快速混勻器（天津藥典標準儀器廠）；氮氣吹干儀（上海鄆曹電子科技有限公司）。

1.2 試藥

右旋酮洛芬氨丁三醇（武漢遠成共創科技有限公司，批號為20190215）；右旋酮洛芬氨丁三醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為180316-20150，純度為99.36%）；萘普生鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100330-200702）；聚丙烯酸Viscomate NP800（山東精細化工有限公司，批號為20180926）；氮酮（浙江利康化工有限公司，批號為20190621）；EDTA（天津市百世化工有限公司，批號為20080609）；聚維酮K-90（國藥集團化學試劑有限公司，批號為7600162502）；尿素（青島海洋化工廠，批號為20081126）；甘羥鋁（批號為20190618）、丙二醇（批號為20190118）均購自天津市福晨化學試劑廠；油酸（批號為20190230）、N-甲基吡咯烷酮（批號為20190619），均購自天津市博迪化工有限公司；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.3 動物

Wistar大鼠，雄性，體質量為（200±20）g，動物合格證號為SCYY（鄂）2019-0011；比格犬，6只，雌雄各半，體質量為（15±0.2）kg，動物合格證號為SCYY（鄂）2019-0028。所有動物均由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，試驗的操作規程和協議都按照湖北醫藥學院動物保護和使用委員會頒布的試驗動物使用和保護指導守則進行。Wistar大鼠和比格犬每天供給統一的飼料和水，飼養溫度為室溫（20～24℃）。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件[5]

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×6.0 mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖溶液（68 g磷酸二氫鉀溶于1 000 mL水中，磷酸調節pH至3.5）-乙腈-水（2∶43∶55，V/V/V）；測定波長：257.00 nm；流速：1 mL/min；進樣量：20μL；柱溫：35℃。

2.1.2 溶液制備與測定

取DKT對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配制成質量濃度為800 mg/L的對照品溶液，備用。取DKT對照品溶液、空白貼劑（陰性對照品溶液）和DKT貼劑的透皮吸收試驗的接收液（供試品溶液），經0.22μm微孔濾膜過濾，按擬訂色譜條件進樣分析。DKT的保留時間為9.26 min，色譜圖見圖1。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：將對照品溶液用流動相稀釋為質量濃度分別為2，10，20，100，200，400，800 mg/L的系列溶液。分別取20μL，注入色譜儀，按擬訂色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣質量濃度（X，mg/L）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=9 258X-165（r=0.999 8）。結果表明，DKT質量濃度在2～800 mg/L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為100 mg/L的對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣20μL，連續測定3 d。結果DKT的日內RSD和日間RSD分別為0.21%和0.48%（n=6），表明儀器精密度良好。

（2）教師要深入把控教學生成問題。“植物的生殖”一課中，教師采用了生物學中常用的對比學習法，對有性生殖和無性生殖兩種生殖方式在形成過程、遺傳特性、與母體的性狀一致性和后代個體變異等多個方面進行對比的同時，讓學生體會到兩種生殖方式各有利弊，從而知道：人們應當趨利避害，取長補短，在植物不同的生命階段，采用不同的生殖方式以繁衍后代。在課堂中，教師還需分配更多時間、列舉更多例子來幫助學生分析和理解為了適應環境以實現種族的繁衍，兩種生殖方式應當如何合理搭配應用，將理論聯系生活實際，服務于農業生產。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的DKT供試品溶液1.0 mL，置10 mL刻度管中，共9份，每組3份，分別精密加入100 mg/L的對照品溶液0.2，0.4，0.6 mL，各3份，混勻，經0.45μm微孔濾膜過濾，按擬訂色譜條件進樣20μL，測定峰面積。結果DKT的平均加樣回收率為98.22%，RSD為1.86%（n=9）。

穩定性試驗：取質量濃度為100 mg/L的對照品溶液20μL，分別于0，4，6，12，24 h時進樣測定。結果含量的RSD為0.23%（n=6），表明DKT對照品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2 DKT水凝膠貼劑制備[4]

稱取聚維酮K-90 2 g，EDTA 0.15 g，溶于63.05 g純化水中，加入DKT原料藥2.5 g，攪拌均勻，作為A相；取25 g甘油，依次加入促滲劑適量、甘羥鋁0.3 g、聚丙烯酸Viscomate NP-800 5 g，攪拌均勻，作為B相，處方總量100 g。取大小合適的攪拌鍋，加入B相，攪拌15 min后倒入A相，繼續攪拌1.0 h，靜置0.5 h，均勻涂于無紡布上，蓋上背襯，室溫放置2 h，即得。每片貼劑剪裁為5 cm×10 cm大小，含DKT 0.25 g，含藥膏質量10 g。

2.3 體外經皮滲透試驗[4]

圖1高效液相色譜圖

取處理好的Wistar雄性大鼠腹部離體全皮，固定于改良Franz擴散池（有效擴散面積為1.5 cm2）的兩室之間，角質層面向供給室，將DKT水凝膠貼劑貼在皮膚角質層面上。接受池中加入50 mL PBS緩沖液（pH=7.4）作為接受液，保持磁力攪拌速率為300 r/min，恒溫水浴為（32±0.5）℃。分別于試驗開始后的1，2，4，6，8，10，12，24 h從接受池中取樣0.5 mL，同時補充0.5 mL PBS緩沖液。樣品經0.45μm微孔濾膜過濾，按擬訂色譜條件進樣測定，計算藥物濃度，根據公式[Qn=其中，A為有效擴散面積，V為取樣體積，V0為接受液總體積，Cn和Ci分別是第n個和第i個取樣點的藥物濃度]，計算藥物單位面積的累積經皮滲透量（Qn），以Qn對時間作圖，并對直線進行線性回歸，直線的斜率為滲透速率。

2.4 不同促滲劑對DKT水凝膠貼劑透皮吸收的影響

2.4.1 促滲劑種類及濃度選擇

常用的促滲劑包括有機溶劑類（乙醇、丙二醇、醋酸乙酯、二甲基亞砜及其同類物質）、有機酸、脂肪醇類（油酸、亞油酸、月桂醇）、氮酮及其同系物、表面活性劑、角質保濕與軟化劑類（尿素、水楊酸、吡咯酮類）、萜烯類（薄荷醇、樟腦、檸檬烯）等。參考文獻[5-13]，選擇常用促滲劑尿素、油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮考察其對DKT水凝膠貼劑透皮吸收的影響。促滲劑常用劑量結合試驗中的實際情況，設置以下不同的質量分數進行試驗：5%，10%的尿素；3%，5%的油酸；2%，4%的氮酮；3%，5%的薄荷醇；10%，20%的丙二醇；3%，5%的N-甲基吡咯烷酮。

2.4.2 一元促滲劑的影響

按2.4.1項下選擇促滲劑及不同質量濃度，以不加促滲劑作為空白對照組，計算其累積透過量、穩態滲透速率及促滲倍率。結果見表1。結果顯示，除尿素外，油酸、氮酮、薄荷醇、丙二醇及N-甲基吡咯烷酮對DKT均有一定促滲作用。以4%氮酮的作用最強，10%丙二醇作用次之，促滲效果依次為4%氮酮＞2%氮酮＞10%丙二醇＞5%薄荷醇＞5%丙二醇＞5%油酸＞5%N-甲基吡咯烷酮＞3%薄荷醇。而尿素則顯示了一定程度的抑制作用，且隨著質量濃度的增加，抑制作用增強。

表1一元促滲劑作用下的DKT透皮滲透速率（n=3）

根據一元促滲劑試驗結果選擇合適的促滲劑進行聯用，參考文獻[14-16]，丙二醇具有較好促滲作用，又能增加DKT的溶解度，故主要考察丙二醇與其他促滲劑聯合使用的效果。根據2.4.2項下試驗結果分別設置以下試驗組：5%油酸+10%丙二醇、5%尿素+10%丙二醇、4%氮酮+10%丙二醇、5%薄荷醇+10%丙二醇及5%N-甲基吡咯烷酮+10%丙二醇。按2.3項下方法進行體外透皮滲透試驗，以不加促滲劑作為空白對照組，計算其累積透過量、穩態滲透速率及促滲倍率。結果見表2。可見，丙二醇聯合其他促滲劑的促滲效果明顯優于單一促滲劑，其中以4%氮酮+10%丙二醇聯合使用促滲透作用最強，其促滲倍率提高至無滲透促進劑的3.22倍。

表2多元促滲劑作用下的DKT透皮滲透速率（n=3）

2.5 DKT水凝膠貼劑藥代動力學研究[17-18]

2.5.1 色譜條件[19]

色譜柱：Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：5 mol/L磷酸鹽緩沖溶液-乙腈（73∶27，V/V）；測定波長：260 nm；流速：1 mL/min；進樣量：20μL；柱溫：35℃。

2.5.2 血漿樣品處理

取比格犬血漿200μL，置離心管中，加入10μL萘普生鈉內標溶液（250μg/mL），振蕩，混勻。加入0.1 mL鹽酸（0.1 mol/L），渦旋混勻1 min，加入乙醚3 mL，渦旋混勻3 min。吸取上清液2 mL置離心管中，40℃氮氣儀吹干。殘渣加入200μL甲醇溶解，渦旋混勻1.0 min，12 000 r/min離心5.0 min，取上清液20μL，0.22μm微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件進樣測定。

2.5.3 方法專屬性考察

圖2高效液相色譜圖

取DKT對照品100 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成質量濃度為1 000μg/mL的DKT對照品貯備液。用甲醇稀釋成質量濃度為100，50，10，5，2.5，1.25，0.625μg/mL的對照品系列溶液，置4℃下保存，備用。取萘普生鈉對照品100 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成質量濃度為1 000μg/mL的萘普生鈉對照品貯備液，用甲醇稀釋成質量濃度為250μg/mL的內標溶液，置4℃下保存，備用。分別取比格犬空白血漿，加有DKT和內標萘普生鈉對照品貯備液的空白血漿和樣品血漿，按2.5.2項下方法處理，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。可見，血漿內源性物質不干擾DKT及內標萘普生鈉的測定，DKT的保留時間為10.45 min，內標萘普生鈉的保留時間為8.23 min。詳見圖2。

2.5.4 方法學考察

線性關系考察：取比格犬空白血漿200μL，分別加入2.5.3項下對照品系列溶液20μL，配成10，5，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5μg/mL的標準血漿樣品，按2.5.2項下方法處理，測定DKT與萘普生鈉的峰面積。以DKT的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、DKT與萘普生鈉的峰面積比為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得標準曲線方程Y=17 862X-2 438.6（r=0.998 2）。結果表明，DKT質量濃度在0.062 5～10.0μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：分別取比格犬空白血漿200μL若干份，加入不同質量濃度的DKT對照品溶液，制成高、中、低3個質量濃度（5，0.5，0.125μg/mL）的血漿樣品，混勻后按2.5.2項下方法處理并進樣分析。每個質量濃度配制3個樣本，連續測定3 d，日內及日間各重復5次。結果的RSD均小于4.86%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：將高、中、低3個質量濃度的血漿樣品分別于室溫放置24 h、-20℃冰箱保存24 h、凍融循環（-20℃）3次后，分別按2.5.2項下方法處理。結果血漿樣品DKT含量的RSD均小于4.92%（n=5），表明24 h內血漿樣品穩定性良好。

提取回收率試驗：取高、中、低3個質量濃度（5，0.5，0.125μg/mL）的血漿樣品，按2.5.2項下方法處理，取20μL進樣，得DKT峰面積為A1，另取DKT相同質量濃度標準溶液直接進樣，所得峰面積為A2，依法計算提取回收率。結果提取回收率在92.52%～94.68%之間。

2.5.5 給藥方案與血樣采集

取健康比格犬6只，隨機分為兩組，每組3只，一組為無促滲劑DKT水凝膠貼劑，另一組為DKT水凝膠貼劑（含4%氮酮+10%丙二醇）。給藥前2 d于犬左上腹部剃毛，飼養待用，腹部剃毛區緊密貼敷DKT水凝膠貼劑，給犬穿上棉質背心以防貼劑被撕落。給藥前12 h禁食不禁飲。分別于給藥前和給藥后0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，16，20，24 h時從犬前肢內側下靜脈取血2 mL。按2.5.2項下方法處理，HPLC法測定血藥濃度，并繪制血藥濃度-時間（C-t）曲線，見圖3。可見，DKT水凝膠貼劑的達峰時間較長，且能較長時間內維持較高血藥濃度，具有緩釋藥特征；兩者0～24 h藥時曲線下面積（AUC0→24h）差異顯著，含促滲劑的DKT水凝膠貼劑是無促滲劑的2.48倍，表明兩者體內促滲倍率達2.48倍，含4%氮酮+10%丙二醇促滲劑的DKT水凝膠貼劑具有較好的透皮吸收性能。

圖3右旋酮洛氛氨丁三醇在比格犬體內平均血藥濃度-時間曲線圖（n=3）

采用DAS2.0藥代動力學軟件對藥物濃度-時間數據進行處理，對血藥濃度數據進行曲線擬合，其藥代動力學參數見表3。應用SPSS13.0統計學軟件對兩組貼劑的主要藥動學參數進行分析，行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。DKT水凝膠貼劑給藥后的平均血藥濃度-時間曲線均符合二室模型。與無促滲劑組相比，DKT水凝膠貼劑達峰濃度（Cmax）及AUC0→24h均顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表3比格犬給藥后主要藥代動力學參數（±s，n=3）

表3比格犬給藥后主要藥代動力學參數（±s，n=3）

注：與DKT水凝膠貼劑（無促滲劑）比較，*P＜0.05。tmax為達峰時間，Cmax為峰濃度，t1/2α為分布相半衰期，t1/2β為消除相半衰期，AUC為血藥濃度-時間曲線下面積，MRT為平均滯留時間。

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3 討論

對于透皮性差的藥物，促滲劑發揮著重要作用，選擇合適的促滲劑是制劑研究中非常重要的一環。目前，促滲劑既可單獨使用，也可聯合使用。本研究中考察了一元促滲劑及多元促滲劑對DKT水凝膠貼劑的影響，結果表明，聯合使用促滲劑的促滲效果明顯優于單一促滲劑。其中，4%氮酮聯合10%丙二醇的促滲透作用最強。氮酮主要作用于細胞脂質雙分子層，對生物膜類脂具有特異性溶解和破壞作用，能增加類脂膜的不連續性，對親水性藥物的促滲作用較強。丙二醇增加促滲劑及藥物溶解度的同時可發揮協同作用，可滲入皮膚，溶解α-蛋白，并與之形成氫鍵，減少α-蛋白與藥物的結合，從而促進藥物的透皮吸收，但高濃度的丙二醇可能對皮膚產生傷害及刺激[20]。氮酮與丙二醇聯合使用產生協同作用，其促滲倍率提高至無滲透促進劑的3.22倍，可以選擇其作為DKT水凝膠貼劑的促滲劑。以5%尿素+10%丙二醇的效果最差。尿素作為角質層水化劑，顯示出滲透抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強，作用機制尚不清楚，與丙二醇合用后，兩者的聯合促滲透作用有所提高。此外，5%油酸、5%薄荷醇及5%N-甲基吡咯烷酮與丙二醇合用后，促滲透能力均有較大幅度提升。

在DKT水凝膠貼劑的處方研究中，本研究中重點考察了不同促滲劑及其聯用對DKT透皮吸收的影響，以離體皮膚為參考，本研究中進一步考察了該貼劑在大鼠體內的藥代動力學參數，可為臨床應用提供參考。

DKT水凝膠貼劑在比格犬體內符合二室模型，含促滲劑組與無促滲劑組的藥代動力學參數AUC0→24h分別為（26.22±1.17）mg·h/L、（10.56±0.32）mg·h/L，兩者比值為2.48，表明含促滲劑體內促滲倍率達2.48倍，與體外試驗促滲倍數（3.22倍）相比有差異，說明透皮吸收體內與體外試驗具有相關性，但有一定差異。