基于特異性適配體封蓋介孔納米材料的T-2毒素快速檢測技術

徐群博，譚紅霞，馬 良

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

T-2毒素是一種由多種鐮刀霉菌產生的真菌毒素，對多種糧食作物造成污染[1]。T-2毒素對動物體的生殖系統[2]、免疫系統[3]、神經系統[4]等都具有一定毒性作用，且由于強烈的急性毒性，T-2毒素在近幾十年內仍被用于生物戰劑中。由于具有與黃曲霉素相似的毒性和危害，對于T-2毒素的研究正逐漸成為新的熱點。在中國，對于T-2毒素的檢測是谷物、食品、動物飼料等安全檢測的必要環節。目前，主要的T-2毒素檢測方法包括高效液相色譜法[5]、氣相色譜-質譜聯用法[6]、氣相色譜法[7]、酶聯免疫法[8]等，國家標準對于其中的部分T-2毒素檢測方法進行描述[9-10]。目前的快速檢測方法主要包括酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測和金標試紙條等技術[11]，其原理均為基于抗原抗體特異性免疫反應的標記型檢測方法，需要通過標記酶、膠體金或發光材料等提高檢測靈敏性。其中，ELISA方法是主流的檢測方法，采用試劑盒形式，檢測時間約為3 h，適合高通量定性或半定量篩查。而試紙條技術的檢測時間較短，但主要進行定性篩查。開發非標記型、低成本T-2毒素快速定量檢測方法對快速準確識別T-2毒素污染和控制其風險有非常積極的作用。

介孔二氧化硅納米（mesoporous silica nanoparticles，MSN）材料具有表面多孔、性質穩定等多種優點，可以通過空穴起到運輸、富集微粒的作用，已有報道用于藥品的裝載以及物質的檢測[12-14]。核酸適配體能與目標物質高特異性、高選擇性地結合，在生物傳感器的研究與物質檢測中受到廣泛運用[15-19]。本研究期望構建一種以MSN材料和T-2毒素特異性適配體為基礎，以熒光信號探針羅丹明6G（Rhodamine 6G，Rh6G）染料為直接檢測物，通過體系釋放的染料探針熒光強度和毒素質量濃度之間的關系，間接檢測T-2毒素含量的非標記型T-2毒素快速檢測方式，相較于ELISA方法，該方法采用適配體作為免疫識別器，降低了檢測成本，同時由于免去了標記過程，縮短了毒素檢測所需的時間，更適用于非實驗室環境下的快速定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3-氨丙基三乙氧基硅烷（(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES）、正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、Rh6G 美國Damas-beta公司；NaOH 中國重慶川東化工（集團）有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB） 美國Biosharp公司；T-2毒素、黃曲霉素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉素G1（aflatoxin G1，AFG1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（ochratoxin，OTA） 美國Sigma公司；T-2適配體（gTA TAT CAA gCA TCg CgT gTT TAC ACA TgC gAg Agg CgA A） 生工生物工程（上海）股份有限公司；所有材料與試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；F-2500熒光分光光度計 日本日立公司；臺式高速離心機德國Eppendorf公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 MSN的制備

參照文獻[20-22]方法。取0.5 g CTAB置于圓底燒瓶中，加入240 mL超純水使CTAB充分溶解，用油浴加熱到80 ℃，加入1.75 mL 2 mol/L的NaOH溶液。在劇烈攪拌下，逐滴緩慢加入2.50 mL TEOS，反應2 h后，靜置冷卻，將生成的白色絮狀沉淀在10 000 r/min離心12 min，將沉淀與液相分離，所得產物依次用乙醇和水洗滌3 次，放入真空冷凍干燥箱中過夜干燥，即可得到含有模板CTAB的MSN。

將干燥好的顆粒放入馬弗爐中，調節溫度至550 ℃，灼燒5 h，即可得到除去模板的MSN顆粒。

1.3.2 氨基修飾的MSN的制備

參照文獻[21, 23-26]方法。稱取0.5 g MSN顆粒，分散于50 mL含有1.5 mL APTES的無水乙醇中，在110 ℃熱油浴中緩慢攪拌10 h，將沉淀物在12 000 r/min離心10 min，所得產物依次用乙醇和水洗滌3 次，放入真空冷凍干燥箱中過夜干燥，得到氨基修飾的MSN顆粒（NH2-MSN）。

1.3.3 適配體封蓋及可行性分析

準確稱取 30 mg NH2-MSN置于離心管中，加入500 μL 1 mmol/L的Rh6G溶液，于25 ℃振蕩12 h，然后加入200 μL 50 μmol/L的核酸適配體，于25 ℃封蓋5 h，將多余的染料洗脫。將裝載有Rh6G的適配體封端的MSN重新分散到磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）中。

準備2 組20 μL上述顆粒分散液，其中一組加入質量濃度為10 ng/mL的T-2毒素溶液，另外一組作為對照。兩組溶液分別于37 ℃反應2 h后，離心，取上層清液在25 ℃測定熒光強度，記錄樣品的熒光光譜。比較兩組溶液的熒光強度。測試過程采用信號探針羅丹明的最大激發波長（480 nm），掃描波長范圍為530～600 nm[27]。

1.3.4 影響熒光強度的關鍵反應過程條件分析

以1.3.3節方法為基礎，在NH2-MSN、Rh6G的量以及封蓋、反應及檢測溫度不變的情況下，分別研究適配體封蓋濃度、封蓋時間、與毒素反應時間對于檢測后熒光強度的影響。設置濃度分別為5、10、20、40、50、75、100 μmol/L；設置封蓋時間分別為40、70、120、150、180、240、300 min；設置反應時間分別為40、70、90、120、150、180、300 min。分別檢測熒光強度并比較各項研究中各組之間熒光強度的差異。

1.3.5 T-2毒素質量濃度與熒光強度之間的線性關系分析

在1.3.4節研究確定的條件下測定不同質量濃度（0、0.005、0.05、0.5、1、2、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250 ng/mL）T-2毒素的熒光強度，以毒素質量濃度為橫坐標、熒光強度為縱坐標繪制標準曲線，通過曲線得出該方法的毒素檢測范圍，以3 倍空白對照組熒光強度對應的毒素質量濃度為檢出限。

1.3.6 特異性分析

在1.3.4節研究確定的條件下，測定干擾毒素（AFB1、AFG1、OTA、ZEN）的熒光響應值，對比T-2毒素的熒光響應值分析方法特異性。

1.3.7 方法準確度分析

以玉米、大麥、小麥等作物[28]為檢測樣品，向檢測樣品中加入T-2毒素標準品溶液，浸泡過夜后揮干溶劑，配制成不同水平的加標陽性樣本，其處理方法為：將5 g加標樣品粉碎后分散在20 mL乙腈-水（7∶3，V/V）溶液中，超聲處理2 min（過程中每分鐘取出旋渦振蕩0.5 s），靜置10 min后在15 000 r/min離心15 min，兩次。將上清液稀釋100 倍后添加不同含量的T-2毒素制配成為不同水平的加標陽性樣品。按照1.3.3節方法檢測并計算回收率。

1.4 數據統計及圖表繪制

各實驗重復3 次，各樣品的指標進行3 次平行測定，結果以表示。使用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析（P＜0.01，差異顯著），用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 T-2毒素的檢測策略構建及可行性分析

如圖1所示，將具有熒光特性的Rh6G作為信號探針裝填在MSN的孔穴中，MSN表面的氨基和T-2毒素特異性核酸適配體通過靜電作用結合，從而對材料上的孔穴進行封蓋，當目標檢測樣中存在T-2毒素時，介孔表面的T-2毒素特異性適配體會與T-2毒素發生特異性的結合并使適配體脫離介孔材料，以此實現孔蓋的打開，熒光探針隨之被釋放出來，通過檢測熒光信號探針相應熒光信號變化情況值間接反映T-2毒素含量。

圖1 T-2毒素檢測策略原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram showing the principle of toxin detection usin MSN

按照1.3.3節方法對該方法進行可行性分析，如圖2所示，未加入毒素時，溶液的熒光值較低，當加入10 ng/mL的T-2毒素溶液時，熒光值顯著升高，這是由于T-2毒素與適配體發生特異性結合導致適配體脫落顆粒表面釋放出Rh6G導致，以上結果表明該方法可行，結果與設計的檢測策略一致。

圖2 接觸靶標T-2毒素前后體系的熒光強度變化（CT-2＝10 ng/mL）Fig. 2 Changes in fluorescence intensity of the system before and after exposure to T-2 toxin (CT-2 = 10 ng/mL)

2.2 NH2-MSN表征分析

按照1.3.1節方法合成NH2-MSN材料，采用透射電子顯微鏡進行表征，結果如圖3所示，所合成的NH2-MSN顆粒分散性良好，粒徑大小均一，可以看到明顯的微孔結構，顆粒呈球形，尺寸在100 nm以內，屬于納米級介孔型富集材料。

圖3 透射電鏡表征結果Fig. 3 TEM image of MSN

圖4 MSN與N2-MSN材料的紅外光譜（A）和Zeta電位（B）表征結果Fig. 4 FTIR spectra (A) and zeta potential (B) of MSN and NH2-MSN

如圖4所示，MSN的FTIR譜圖中僅有二氧化硅的振動峰，而NH2-MSN在1 500 cm－1（圖4A）附近出現了氨基的特征峰，表明顆粒表面已修飾上氨基。同時，圖4B中MSN顆粒電位為－27.2 mV，NH2-MSN電位為19.7 mV，電位明顯升高，進一步表明顆粒表面修飾上了氨基。參考文獻[27]可以得出結論，微粒表面成功修飾了大量氨基，有大量氨基與適配體產生靜電結合，將熒光信號探針Rh6G封蓋在微粒的孔穴中，實現信號探針的富集，此時為檢測前體系，反應較低但較穩定的熒光強度。

2.3 體系條件對熒光強度的影響

2.3.1 T-2適配體濃度對熒光強度的影響

適配體封蓋濃度與時間是影響微粒表面適配體吸附量主要因素，而適配體吸附量直接影響了方法的檢測效果，當表面附著當適配體吸附量較少時，由于Rh6G無法被完全封蓋在孔隙之中，導致在洗脫外部染料時，部分孔隙中的染料由于缺乏適配體的阻擋散逸在洗脫液中，導致在反應后熒光強度偏小，檢測性能較差；而當適配體的吸附量過大時，即使核酸適配體與T-2毒素結合，可能仍有適配體封蓋在NH2-MSN的表面，從而影響Rh6G的釋放，使熒光強度偏低，檢測性能偏小。因此對于適配體封蓋濃度、時間的研究十分必要。

圖5 T-2毒素適配體濃度對反應體系熒光強度的影響Fig. 5 Effect of T-2 toxin aptamer concentration on fluorescence intensity of reaction system

由圖5可知，隨著適配體濃度增加，各適配體濃度下的熒光強度呈現先上升后下降的趨勢，可以推測出隨著適配體濃度的上升，首先更多的Rh6G被封蓋在微?？籽▋?，而部分孔穴由于適配體濃度不足仍然無法封蓋導致洗脫后微粒中的染料數量偏低，當適配體濃度增加時，首先所有的孔穴都被封蓋，反應后熒光強度達到最高。但適配體濃度繼續增大時，即使適配體與目標物T-2毒素結合，可能仍有少量的適配體封蓋在介孔顆粒的表面，從而影響了Rh6G的釋放，其熒光強度下降。因此，T-2核酸適配體封蓋濃度采用50 μmol/L。

2.3.2 T-2適配體封蓋時間對熒光強度的影響

由圖6可知，隨著封蓋時間的延長，體系中的熒光強度首先上升，直到3 h時趨于平緩。這是由于隨著封蓋時間延長，更多的適配體附著在微粒表面并將Rh6G染料被封蓋在孔隙之中，當封蓋時間到達3 h后，體系中的適配體幾乎完全附著在納米材料表面，從而達到封蓋的目的，使得更多的Rh6G富集在納米材料內，提高T-2檢測的靈敏度。因此，T-2核酸適配體封蓋時間采用3 h。

圖6 N2-MSN封蓋時間對反應體系熒光強度的影響Fig. 6 Effect of capping time of NH2-MSN on fluorescence intensity of reaction system

2.3.3 毒素反應時間對熒光強度的影響

如圖7所示，隨著反應時間的延長，熒光強度呈現先上升后趨于平穩的趨勢，且熒光強度在2 h時達到最高。這是由于隨著反應時間的延長，更多的適配體與T-2毒素特異性結合，使得適配體從NH2-MSN表面脫離，釋放出孔穴中的Rh6G。當反應2 h后，T-2與適配體反應完全，無法再使更多的適配體脫離，體系中的Rh6G濃度不再發生變化，隨著反應時間的延長，熒光強度也不再發生較大變化，因此采用2 h作為與毒素反應時間。

圖7 反應時間對反應體系熒光強度的影響Fig. 7 Effect of reaction time on fluorescence intensity of reaction system

2.4 體系檢測的線性范圍

以2.3節優化條件對不同濃度的T-2毒素進行檢測。以不同質量濃度的T-2毒素為橫坐標、熒光強度為縱坐標繪制標準曲線圖，如圖8所示，隨著T-2毒素質量濃度的增加，熒光強度逐漸增大，說明隨著體系中毒素的增加，更多的適配體與毒素發生特異性結合并離開微粒表面，從而導致更多的熒光染料被釋放，熒光強度不斷上升。從圖8可以看出，該分析方法在0～50 ng/mL或50～200 ng/mL之間具有較好的線性關系，當T-2毒素質量濃度在0～50 ng/mL之間時，其線性回歸方程為y＝9.750 2x＋64.939，R＝0.993，當T-2毒素質量濃度在50～250 ng/mL時，其線性回歸方程為y＝1.697 0x＋497.90，R＝0.977。該方法檢出限為1.25 ng/mL。實際應用時可以根據不同毒素含量水平選擇不同線性范圍計算。

圖8 T-2毒素質量濃度與熒光強度關系Fig. 8 Correlation between T-2 toxin concentration and fluorescence intensity

2.5 特異性分析

圖9 方法特異性Fig. 9 Selectivity of the detection method for different toxins

圖9 顯示，在相同實驗條件下，體系對T-2毒素檢測效果最好，其他干擾毒素的響應很低，甚至無響應，說明T-2毒素適配體和本檢測體系對其他的毒素無法形成特異性識別，因此依然吸附在微粒表面，無法釋放在體系中，熒光強度變化值較小。因此，該方法對T-2毒素具有較好的選擇性，在使用過程中受其他毒素的影響較小，可以用于T-2毒素的特異性檢測。

2.6 方法的準確度和精密度結果

按照1.3.7節方法進行加標回收實驗，結果如表1所示，利用傳感器檢測的加標回收率在85.8%～111.4%范圍內，且相同質量濃度下測得數據標準差較小，相對標準偏差在4.6%以內，說明該檢測方法具有較好的準確性和精密度，可用于真實復雜樣品中T-2毒素的測定。

表1 實際樣品加標回收率（n＝3）Table 1 Recoveries of the method for spiked samples (n= 3)

3 討 論

本實驗建立一種非標記型基于介孔二氧化硅材料結合適配體封蓋的T-2毒素檢測技術，可有效避免目前主流的標記型方法在使用標記過程對抗體等免疫產品活性造成影響的問題。通過實驗發現，本方法檢測結果呈現較好的準確性、精密性和特異性，具有高靈敏度，且線性范圍較寬是一種簡單快速有效的非標記型T-2毒素定量檢測方式。與目前我國主流快檢技術中的ELISA等標記型檢測方法相比，本法檢測時間不超過2 h，檢測速度略高于ELISA方法約1 h；但本方法屬于非標記型方法，且原理不需要競爭抑制作用，因此省去了檢測產品標記過程，最大限度保護了免疫產品（抗體、適配體）活性，也避免了ELISA方法中酶標抗原（酶標毒素）的使用，對操作人員和環境更為安全；而且本方法在同等高靈敏度水平的前提下線性范圍明顯寬于ELISA，可有效用于各污染水平范圍的樣品測定。因此，本研究方法可以在較寬的線性范圍內進行T-2毒素快速靈敏的定量檢測。本實驗構建的該方法思路和材料具有其他毒素檢測應用的普適性，可以通過不同毒素適配體和條件的研究進行推廣應用。