利用低場核磁共振及成像技術鑒別注水肉糜

蓋圣美，游佳偉，張雪嬌，張中會，劉登勇,2,

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

豬肉糜作為餃子、包子、香腸等傳統食品的原材料，在我國具有廣闊的市場，產量極大，其品質好壞與對應產品的質量密切相關[1]。目前，由于國內市場上存在肉糜及其制品生產標準不夠完善，相關監管部門的管理力度欠缺等問題，導致一些不法生產者在實際生產中為牟取利益，用劣質原料取代優質原料，嚴重者直接往肉糜中注水、注膠等摻假現象，這種欺詐行為不僅損害了消費者的利益，而且對消費者的健康造成極大的安全隱患[2-4]。因此，建立準確、靈敏、快速的肉類摻假鑒別方法，對保障肉類安全、維護消費者權益都具有重要的現實意義。

近年來，一些新興的方法逐漸被應用于摻假肉類的檢測中，如微波法[5]、生物電阻抗技術[6]、激光誘導擊穿光譜技術[7]、近紅外光譜成像技術[8-9]、多光譜成像技術[10-11]、高光譜成像技術[12-14]等，但這些方法存在檢測設備造價昂貴、對操作人員技術要求較高等弊端。與這些檢測方法相比，低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術不僅具有檢測速度快、對樣品無損傷、無需預處理、實時獲得數據等特點，同時還能夠反映樣品中水分子的存在形式及分布狀態[15-16]。

LF-NMR是利用氫原子在磁場內受到一定頻率的射頻脈沖激發后，產生磁共振現象的物理學原理，雖然常溫下1H核在靜磁場中進行了塞曼能級分裂，但低能級和高能級上的核數之差非常小，所以需要一定的射頻脈沖激發使其發生能級躍遷，以獲得樣品內部質子密度與分布，進而分析得到樣品中水分分布狀態[17-18]。目前，該技術在摻假食品的檢測方面得以廣泛應用。可對摻假牛奶進行定性、定量檢測，LF-NMR結果發現，牛奶樣品中的水分子僅有一種結合狀態，且不同摻假比例的樣品中弛豫時間存在明顯差異；通過偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）模型可以對摻假比例進行很好預測（均方根誤差（root mean square error，RMSE）為2.35%）[19]。Zhu Wenran等[20]利用LF-NMR技術結合化學計量學方法對摻假比例為10%～90%的花生油進行檢測，結果發現隨著摻假比例的增加，單組分弛豫時間（Tw）、多組分峰面積比（S21、S22）呈現線性變化；通過主成分回歸（principal component regression，PCR）法能明顯將正常花生油和摻假花生油區分。Li Min等[21]利用LF-NMR和MRI技術結合PCR對注膠蝦進行檢測分析發現，通過T2弛豫特性可以將注膠蝦從正常蝦中檢出，此外通過MRI技術能清楚觀測到所注射的膠體在蝦中的分布情況。雖然LF-NMR技術在肉類摻假檢測方面得以廣泛應用，但多局限于對樣品的定性分析，在定量檢測方面還相對較少[22-26]。

本實驗主要利用LF-NMR技術分析注水肉糜中水分分布的變化，并結合PCR法對注水肉糜進行有效區分；通過建立回歸預測模型對注水肉糜摻假比例進行預測；還利用MRI技術觀察注水肉糜中水分的空間分布情況，以期可直觀地對注水肉糜進行區分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉背最長肌購自天添食品有限公司，冷藏條件下帶回實驗室進行實驗。

1.2 儀器與設備

PQ001型低場核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；PL203型電子天平 英國梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

隨機選擇10 條新鮮的豬背最長肌，去除表面的脂肪及結締組織后，用絞肉機打碎成糜狀。原料肉不添加任何物質，即為正常肉。肉糜總共分為135 份，每份100 g。取其中的90 份肉糜，分為6 組，以4%的梯度向肉糜中注入去離子水并充分混勻，配制注水量為0%、4%、8%、12%、16%、20%的模擬注水肉糜，建立預測模型。取剩余45 份肉糜，分為3 組，配制成5%、10%、15%的模擬注水肉糜，用來評估預測模型。

1.3.2 注水肉糜水分子弛豫信息采集

取2 g左右的肉糜樣品于核磁管中，把裝有樣品的核磁管加塞后放入低場核磁設備磁體腔中采集T2弛豫信息。LF-NMR測試參數為：質子共振頻率22 MHz；重復采樣等待時間3.5 s；半回波時間150 μs；回波個數5000；重復掃描次數16。

1.3.3 核磁共振成像

不同比例注水肉糜的核磁成像實驗，成像方式為冠狀面成像，脈沖序列為自旋回歸脈沖序列，具體參數為：中心頻率22 MHz，信號采樣點數400，采樣頻率20 kHz，重復采樣等待時間1 000 ms，回波時間6 ms，采樣層數1，采樣厚度2 mm，重復采樣次數8。

1.4 數據處理與分析

所有的肉糜樣品分為校準集、驗證集兩組，注水比例為0%、4%、8%、12%、16%、20%的樣品作為校準集，建立預測模型。注水比例5%、10%、15%的樣品作為驗證集，用來評價預測模型的準確性。以校準集肉糜樣品的5 000 個回波峰點作為自變量x，水分含量作為因變量y，用Unscrambler 9.7數據分析軟件（version 9.7，CAMO software AS，Oslo，Norway）對自變量x和因變量y進行PLSR、PCR擬合，得到PLSR、PCR預測模型[27]。把驗證集樣品的5 000 個回波峰點代入PLSR、PCR預測模型，得到驗證集中肉糜注水比例的預測值。預測模型的評價分別從決定系數R2和RMSE兩個方面考慮。R2和RMSE分別根據式（1）、（2）計算[28]：

式中：R2為決定系數；n為肉糜樣本數；yi為肉糜樣品真實水分含量；為yi的平均值；為肉糜樣品預測水分含量。

式中：RMSE為均方根誤差；yi為肉糜樣品真實水分含量；為預測水分含量；n為樣本數。

PCR是在保留原始變量主要信息的前提下，把多個指標轉化為少數幾個綜合指標的一種多元數據統計方法[29]。通過將多變量的信息進行數據轉換和降維，使數據可視化。利用降維后的特征向量形成散點圖，直觀地反映樣品之間的差異。

用系統自帶反演軟件對CPMG衰減曲線進行單組分反演得到注水肉糜的單組分弛豫時間，通過多組分反演得到注水肉糜中結合水、不易流動水、自由水的弛豫時間、峰面積、峰面積比；用SPSS 19.0數據分析軟件對數據進行差異顯著性分析、PCR；通過Unscrambler 9.7數據分析軟件建立和驗證PLSR、PCR模型；用Origin 8.5繪制相關圖形；用系統自帶成像軟件獲取注水肉糜的MRI圖像，隨后通過Matlab2016a數據分析軟件對所得MRI圖像進行偽彩處理。

2 結果與分析

2.1 不同注水肉糜的CPMG衰減曲線

由圖1可以看出，正常肉糜、注水肉糜由于樣品內部水分子數量及可移動性的差異使CPMG曲線表現出不同的衰減特征[30]：正常肉糜由于水分含量少、水分子流動性相對較弱，CPMG衰減曲線的信號強度較弱且呈衰減速率快（曲線曲率大）的特點；肉糜注水后其水分含量增加（質子數隨之增加）、水分子流動性增強，CPMG衰減曲線的信號強度較強且呈衰減速率慢（曲線曲率小）的特點。正常肉糜、注水肉糜CPMG衰減曲線的差異主要集中在0～600 ms范圍內，說明這是區分正常肉糜、注水肉糜的重要信號區域。在該區域內，隨著注水比例的增加，衰減曲線的曲率隨著注水比例的增加逐漸減小，信號完全衰減的時間也隨之延長，水分子的流動性增強。

圖1 不同注水比例肉糜的CPMG衰減曲線Fig. 1 CPMG attenuation curves of ground meat samples with different proportions of injected water

2.2 注水對肉糜單組分弛豫時間的影響

圖2 注水比例對肉糜單組分弛豫時間的影響Fig. 2 Effect of different proportions of injected water on singlecomponent relaxation time in ground meat samples

由圖2可以看出，隨著注水比例的增加，肉糜的組分弛豫時間Tw呈線性增加的趨勢（R2＝0.953 5）。Tw增加主要是由于去離子水的摻入，使得肉糜中的水分含量增加、水分子流動性逐漸增強，從而導致肉糜整體的弛豫過程變慢，弛豫時間延長。

2.3 注水比例對肉糜多組分弛豫特性的影響

由圖3可以看出，正常肉糜、注水肉糜多組分弛豫圖譜上均存在4 個明顯的水分群，T2弛豫時間分別在0.1～1、1～10、10～100、100～1 000 ms范圍內，分別對應肉糜中的緊密結合水（T2b）、結合水（T21）、不易流動水（T22）、自由水（T23）[31-32]，與注膠蝦[21]、循環凍融海參[32]中的水分分布一致。

圖3 不同注水比例肉糜的多組分擬合橫向弛豫圖譜Fig. 3 Distribution of multi-exponentially fitted transverse relaxation time spectra of ground meat samples with different proportions of injected water

圖4 不同注水比例對肉糜弛豫時間（A）和峰面積比（B）的影響Fig. 4 Effect of different proportions of injected water on relaxation time (A) and peak area ratio (B) in ground meat samples

由圖4A可以看出，相對于正常肉糜，注水肉糜的T2b值未發生顯著變化（P＜0.05），而T21、T22、T23均顯著增加。這說明緊密結合水的流動性在注水后未發生明顯改變，而結合水、不易流動水、自由水在注水后流動性明顯增強。P2b、P21、P22、P23分別為T2b、T21、T22、T23所對應峰的積分面積占總積分峰面積的百分比，由圖4B可以看出，在所有處理組中，P2b、P21值最小，注水前后均為2%左右，對肉中水分分布的影響可以忽略不計。所有組的P22值均在85%以上，說明不易流動水是肉糜中水分子的主要存在形式[33]。相對于正常肉糜的P22值，各注水組的P22值均有所減小，其中當注水比例大于8%時，P22值減小顯著（P＜0.05）。P23的變化與P22相反，正常肉糜的P23值為2.21%，注水后肉糜的P23值增加了3.16%～11.84%，其中當注水比例大于8%時，P22值相對于正常肉糜增加顯著（P＜0.05）。

2.4 PCR結果

圖5 不同注水比例肉糜主成分得分圖Fig. 5 Principal component score plots of ground meat samples with different proportions of injected water

為了區分正常肉糜和注水肉糜，通過PCR對不同比例注水肉糜的核磁數據進行降維處理，得到PC1、PC2，如圖5所示。PC1、PC2的貢獻率分別為88.69%、10.41%，而累計貢獻率達99.10%。從不同注水比例肉糜在得分圖上的分布看，正常肉糜與注水量較少的肉糜（4%、8%）分布在主成分得分圖的左側區域，而注水量較高的肉糜（12%、16%、20%），則分布在得分圖右側區域。且隨著注水比例的增加，肉糜PC1的得分逐漸增加，而PC2得分則是先增加后減小。可以說明，注水后的肉糜可以通過PCR的方法從正常豬肉中區分出來。與本實驗類似結果有，Li Min等[21]利用LF-NMR及MRI技術研究了注膠蝦，結果表明注射不同濃度明膠的對蝦在主成分得分圖上可以得到很好地區分；Santos等[19]利用LFNMR技術分析了摻假牛奶，結果表明不同摻假比例的牛奶可以在主成分得分圖上得到區分；Zhu Wenran等[20]利用LF-NMR技術結合PCR、判別分析的方法研究了花生油摻假，結果表明花生油摻入不同比例的大豆油、菜籽油或棕櫚油后都可以從主成分得分圖上得到區分。

2.5 利用多元回歸模型預測肉糜的注水比例

由圖6、7可以看出，PLSR預測模型校準集和PCR模型校準集的都是0.97，決定系數均在0.95以上，且RMSE值均在1.5%以下，說明不同注水比例肉糜的預測模型擬合結果較好。PLSR、PCR驗證集結果表明，不同注水比例肉糜的真實值與預測值的決定系數均在0.90以上，RMSE值均不超過1.50%，這說明LF-NMR結合PLSR、PCR模型可以準確地預測注水肉糜中增加的水分。通過進一步比較PLSR、PCR模型發現，PLSR、PCR模型驗證集RMSE分別為1.27%、1.25%，相差僅為0.02%，說明PLSR、PCR模型的預測結果基本一致。Zang Xiu等[27]利用LF-NMR技術，通過建立PLSR、PCR預測模型的方法，對小黃魚中的水分含量和脂肪含量做了預測分析，同樣也發現PLSR模型與PCR模型的預測結果基本一致。

圖6 注水肉糜PLSR模型建立和驗證的散點分布圖Fig. 6 Scatter plots of calibration and prediction sets for PLSR model

圖7 注水肉糜PCR模型建立和驗證的散點分布圖Fig. 7 Scatter plots of calibration and prediction sets for PCR model

2.6 注水肉糜質子加權成像

圖8 注水肉糜質子加權成像Fig. 8 Proton density-weighted images of water-injected ground meat

通過質子密度加權成像的方法對注水肉糜中的水分分布情況進行可視化處理。由于質子密度加權成像的信號強度取決于樣品中的質子數，而水分子又是肉糜中質子的主要來源，因此，樣品中的水分含量越高，質子密度圖像的信號越強，MRI圖像（未做偽彩處理的原始圖像）的亮度也越高。通過對MRI原始圖像進行偽彩處理，可清晰觀測到水分子在肉糜中的分布情況（圖8）。圖中紅色區域表示核磁信號最強、水分含量最高；藍色區域表示核磁信號最弱、水分含量最低；黃色區域的信號強度/水分含量則介于紅色和藍色區域之間。可以看出，正常肉糜的MRI圖像呈藍色，表明正常肉糜的水分含量較低。注水肉糜中，注水比例為4%～12%時，肉糜的MRI圖像呈淺藍色或青色，表明水分含量相比正常肉糜有所增加；注水比例為16%～20%時，肉糜的MRI圖像呈黃色或紅色，表明水分含量相比正常肉糜明顯增加。此外，對單個成像結果進行觀察發現，正常肉糜的MRI圖像顏色呈藍色、顏色較為單一，說明正常肉糜中的水分分布較為均勻，而注水肉糜的MRI圖像左右兩側呈藍色，中心位置呈紅色或黃色，說明注射的水分在肉糜各部位的分布有所差異。

3 結 論

本實驗利用LF-NMR及MRI技術對注水肉糜做檢測分析，對不同注水比例肉糜的CPMG衰減曲線分別進行單組分擬合、多組分擬合處理，結果發現單組分Tw隨著注水比例的增加呈線性增加（R2＝0.953 5）；多組分擬合結果表明，正常肉糜、注水肉糜中均存在4 種水分子，分別對應肉糜中的緊密結合水、結合水、不易流動水和自由水。統計結果表明，不易流動水、自由水弛豫時間相對于正常肉糜均顯著增加（P＜0.05）。通過PCR法對注水肉糜的核磁數據進行降維處理，得到了兩個主成分PC1和PC2，貢獻率分別為88.69%、10.41%，在主成分得分圖上，正常肉糜、不同比例注水肉糜得到了明顯區分。注水比例預測結果表明，PLSR模型與PCR模型的預測結果基本一致RMSE為1.27%；RMSE為1.25%）。MRI結果表明，隨著注水比例的增加，肉糜偽彩圖由藍色逐漸向黃色、紅色轉變，以此可直觀地對注水肉糜進行區分。綜上所述，利用LF-NMR及MRI技術可作為一種檢測注水肉糜的有效方法。