全二維氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

陳麗麗，白春清，袁美蘭，江 勇，趙 利

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，江西 南昌 330013）

魚露是最受歡迎的烹飪醬料之一，具有獨(dú)特的風(fēng)味，給人以味覺上的愉悅。魚露風(fēng)味形成是蛋白質(zhì)和脂肪的氧化分解，形成含有氨基酸、肽等復(fù)雜的呈香、呈味的化合物體系[1]。目前，國(guó)內(nèi)外魚露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究很多，但主要是不同發(fā)酵工藝、風(fēng)味和微生物方面[2-5]的研究，對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和前體物質(zhì)的來源研究較少[6]。魚露風(fēng)味組成相當(dāng)復(fù)雜，Katsuya等[7]通過炙烤香、魚腥味、氨味、酸敗味、奶酪香、肉香描述魚露的特征性風(fēng)味；Pham等[8]通過魚腥味、奶酪味、黃油爆米花味和熟米飯味描述魚露的特征性風(fēng)味；Giri等[9]認(rèn)為魚露的主要特征氣味是堅(jiān)果味、奶酪味、氨味、魚腥味，其中氨、胺類等構(gòu)成氨味。Shimoda等[10]對(duì)魚露進(jìn)行堿化處理，提高了魚露中含氮和含硫化合物的釋放，采用氣相色譜-質(zhì)譜分析法對(duì)魚露的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，鑒定124 種化合物，堿化后對(duì)三甲胺、二甲基二硫等不易被現(xiàn)有方法檢測(cè)到的高揮發(fā)性含氮含硫化合物檢測(cè)得到了加強(qiáng)。大多數(shù)脂類化合物對(duì)風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)，脂類化合物在發(fā)酵過程中經(jīng)過水解和氧化后被降解成酮、醛類等小分子化合物[11]。海水魚中含有多種不飽和脂肪酸如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸[12]，不同脂肪酸含量發(fā)生改變，都對(duì)魚露風(fēng)味的形成有重要的作用。

魚露風(fēng)味物質(zhì)的分析，除了需選擇萃取方法之外，檢測(cè)方法的選擇也同樣重要。全二維氣相色譜是在傳統(tǒng)二維基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，與傳統(tǒng)色譜不同，樣品的組分都經(jīng)過了兩根獨(dú)立色譜柱的分離。分離的組分最后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)到的響應(yīng)信號(hào)經(jīng)過數(shù)據(jù)采集軟件處理后，就會(huì)在計(jì)算機(jī)上得到三維色譜圖。色譜圖的2 個(gè)橫坐標(biāo)代表兩根色譜柱的保留時(shí)間，縱坐標(biāo)代表檢測(cè)器信號(hào)的強(qiáng)度，根據(jù)色譜圖的出峰時(shí)間和峰體積，可以對(duì)每個(gè)組分定性定量分析鑒定[13-15]。全二維氣相色譜具有分離度好、峰容量大、雜質(zhì)干擾較小等特點(diǎn)[16]。主要是由于在色譜柱中樣品經(jīng)2 次獨(dú)立的分離并在第1次分離運(yùn)行的同時(shí)完成二維分離，能夠在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到較多成分信息[13]。目前全二維氣相色譜已經(jīng)被應(yīng)用于環(huán)境、植物和食品等領(lǐng)域內(nèi)，其中一些研究將全二維氣相色譜與質(zhì)譜連接應(yīng)用于食品加工檢測(cè)、食品污染評(píng)估、食品真實(shí)性評(píng)估等食品分析領(lǐng)域[17-20]。使得食品風(fēng)味成分的分析檢測(cè)有了新的突破。

本研究采用靜態(tài)頂空固相微萃取（headspace-solid phase micro extraction，HS-SPME）結(jié)合全二維氣相色譜-質(zhì)譜（full two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry，GC×GC-MS）法分析發(fā)酵過程中魚露揮發(fā)性化合物的變化。取不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過相近發(fā)酵時(shí)間之間進(jìn)行對(duì)比，選擇發(fā)酵過程中變化較明顯的化合物進(jìn)行研究。并結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和保留指數(shù)（retention index，RI）進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法和熱圖分析揮發(fā)性化合物的變化規(guī)律。為探討魚露風(fēng)味的產(chǎn)生機(jī)理以及生產(chǎn)中提高魚露的風(fēng)味口感提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將草魚和鰻魚的內(nèi)臟經(jīng)分段加鹽、低鹽速釀的方法發(fā)酵制備魚露[21]。分別取發(fā)酵過程中第0、5、10、15、20、25、30天和成品魚露為樣品進(jìn)行測(cè)定，所有樣品4 ℃冰箱保存。銀魚魚露由青島正道食品有限公司提供。

混合正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國(guó)Restek公司；2,4,6-三甲基吡啶標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Alfa Aesar公司；氯化鈉（分析純）上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AOC-5000 HS-SPME三合一自動(dòng)進(jìn)樣器 瑞士CTC公司；65 μm PDMS/DVB萃取頭 美國(guó)Supelco公司；GCMS-TQ8050三重四極桿型GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；20 mm聚四氟乙烯磁性蓋頭 德國(guó)CNW公司；20 mL頂空瓶 美國(guó)Altech公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚魚露樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)

1.3.1.1 樣品處理

向20 mL的頂空瓶中加入5 mL魚露樣品和5 g NaCl，振搖1 min，使其達(dá)到過飽和，加入10 μL質(zhì)量濃度為50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品2,4,6-三甲基吡啶，然后用聚四氟乙烯磁性蓋頭迅速密封，置于自動(dòng)進(jìn)樣器中。萃取頭（250 ℃活化30 min）按照程序設(shè)定的萃取條件在頂空瓶中上部吸附樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)，然后插入GC進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)行GC×GC-MS分析。每組樣品分別測(cè)5 個(gè)不同的批號(hào)樣品。

1.3.1.2 檢測(cè)條件

GC條件：色譜柱一：聚乙二醇毛細(xì)色譜柱HP-INNOWax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；色譜柱二：ID-BPX1毛細(xì)色譜柱（10 m×0.1 mm，0.1 μm）。載氣為He（99.999%）；柱前壓為285.7 kPa；柱箱溫度50 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣；流速1 mL/min；進(jìn)樣時(shí)間1 min；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min升溫到250 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲1.5 min后采集信號(hào)；檢測(cè)模式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z45～330。

HS-SPME條件：將頂空瓶（加入處理后的樣品）置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，頂空瓶到達(dá)SPME加熱裝置中，在溫度57 ℃和振蕩頻率510 r/min條件下（250 ℃活化30 min）吸附70 min，然后在GC進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)行GC×GC-MS分析。

1.3.2 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物的聚類分析

對(duì)魚露樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，找出發(fā)酵過程中含量變化較為突出的24 種化合物，再利用HemI 1.0.3.7軟件對(duì)樣品發(fā)酵過程中這些化合物含量的變化進(jìn)行聚類分析，并繪制熱圖。

1.3.3 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物的PCA

通過對(duì)魚露樣品進(jìn)行GC×GC-MS檢測(cè)分析，得到數(shù)據(jù)利用Simca 14.1進(jìn)行PCA，得出相對(duì)應(yīng)的PCA圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析及作圖

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GC Image、MATLB 7.0和Simca 14.1分析。在1.3.1.2節(jié)色譜條件下對(duì)正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行單獨(dú)進(jìn)樣檢測(cè)，得到各個(gè)烷烴的出峰時(shí)間，根據(jù)正構(gòu)烷烴中各個(gè)烷烴的出峰時(shí)間，計(jì)算樣品中揮發(fā)性化合物的RI，然后在NIST Chemistry WebBook網(wǎng)站中根據(jù)化合物的名稱在已發(fā)表的文獻(xiàn)中搜索被測(cè)物質(zhì)的RI，如果2 種化合物的RI誤差在±3%以內(nèi)，則可以對(duì)被檢測(cè)的物質(zhì)定性分析。采用Excel 2010作圖。熱圖采用HemI 1.0.3.7繪制作圖，PCA采用Simca 14.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的鑒定

采用靜態(tài)HS-SPME結(jié)合GC×GC-MS對(duì)魚露發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行檢測(cè)，分別取發(fā)酵的第0、5、10、15、20、25、30天以及成品魚露樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過0 d與5 d、5 d與10 d、10 d與15 d依次類推兩兩之間進(jìn)行比較，找出其中含量變化較大的一些揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行對(duì)比研究，共檢測(cè)出化合物117 種，不同發(fā)酵時(shí)間的魚露樣品中檢測(cè)出來的峰體積結(jié)果如表1所示，包括醇類27 種、醛類6 種、酮類11 種、酸類22 種、酯類13 種、烴類14 種、酚類2 種、雜環(huán)類8 種、苯環(huán)類8 種和其他未分類的化合物6 種。不同的時(shí)間點(diǎn)魚露樣品的揮發(fā)性風(fēng)味化合物的差異較大，這種差異可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中風(fēng)味前體物質(zhì)發(fā)生分解代謝反應(yīng)所產(chǎn)生的[22]。

發(fā)酵0 d，樣品中共檢測(cè)到78 種化合物，其中包括醇類19 種（16.21%）、醛類5 種（9.95%）、酮類9 種（0.67%）、酸類15 種（14.53%）、酯類10 種（21.70%）、烴類8 種（25.96%）、雜環(huán)類2 種（0.13%）、苯環(huán)類5 種（0.19%）和5 種其他類化合物（14.65%）。其中未檢測(cè)到酚類化合物，酯類化合物的含量最高。其中，2,5,8,11,14-五氧雜-16-十六烷醇（6.59%）、N,N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸（5.26%）、潑尼松龍醋酸酯（15.79%）、洋地黃毒苷（9.65%）、四甲基-硅烷（21.56%）等揮發(fā)性物質(zhì)的含量較高。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)到的化合物種類不斷增加，當(dāng)發(fā)酵到第20、25天時(shí)，檢測(cè)到的化合物種類最多為93 種；發(fā)酵第25天時(shí)，檢測(cè)到醇類17 種（9.09%）、醛類5 種（6.79%）、酮類7 種（2.37%）、酸類21 種（16.48%）、酯類11 種（36.34%）、烴類11 種（16.29%）、酚類2 種（1.69%）、雜環(huán)類6 種（0.56%）、苯環(huán)類7 種（0.80%）和6 種其他類化合物（9.61%）。在發(fā)酵前期，酮類、酸類和酯類化合物占比不斷增加，其中酯類化合物占比增加最快，在酯類化合物中潑尼松龍醋酸酯（25.72%）、赤霉素（5.23%）等揮發(fā)性物質(zhì)的含量較高。

發(fā)酵后期，檢測(cè)到化合物的種類稍有下降，這可能是后期加入醬油酵母進(jìn)行賦香發(fā)酵所致。發(fā)酵成品中檢測(cè)到87 種化合物，包括醇類16 種（9.33%）、醛類5 種（7.67%）、酮類6 種（3.58%）、酸類21 種（17.11%）、酯類11 種（30.14%）、烴類12 種（16.85%）、酚類2 種（2.09%）、雜環(huán)類3 種（0.39%）、苯環(huán)類6 種（0.97%）和5 種其他類化合物（11.88%）。其中醛類、酮類、酸類等化合物占比稍有上升，但酯類占比卻有一定的下降，可能是發(fā)酵后期加入的醬油酵母對(duì)酯類的反應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制作用。在發(fā)酵完成的魚露中，檢測(cè)到洋地黃毒苷（7.27%）、維生素A醛（4.65%）、潑尼松龍醋酸酯（22.57%）、四甲基-硅烷（11.82%）等揮發(fā)性物質(zhì)的含量較高。

表1 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成Table 1 Composition of volatile flavor substances in fish sauce during fermentation

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成

由圖1A可知，魚露發(fā)酵過程中風(fēng)味化合物種類大體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，后期明顯高于前期，說明在魚露發(fā)酵期間，其主要風(fēng)味物質(zhì)的形成是在發(fā)酵后期產(chǎn)生的。在發(fā)酵初期，檢測(cè)出的風(fēng)味化合物的種類最少有78 種；從第5～15天時(shí)，風(fēng)味化合物的種類變化有所上升，約有87 種；第20～30天時(shí)，化合物的種類變化達(dá)到最高有93 種；發(fā)酵成品時(shí)，其風(fēng)味化合物的種類又稍有下降，為89 種。在發(fā)酵后期，化合物的種類有所下降，可能是因?yàn)檫@個(gè)階段在發(fā)酵液中加入醬油酵母進(jìn)行賦香發(fā)酵，在增加風(fēng)味成分的同時(shí)可能抑制某些化合物的反應(yīng)。

如圖1B所示，樣品中種類最多的分別是醇類（16.30%～24.36%）和酸類（19.1%～23.6%）化合物，其次是酯類（11.83%～14.10%）和烴類（10.26%～13.48%），而酚類（2.15%～2.30%）最少。在發(fā)酵前期，酸類化合物種類增加，到后期保持不變；醇類化合物第5天時(shí)種類最多，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，種類不斷降低；雜環(huán)化合物的種類呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)；在發(fā)酵初期，魚露中沒有檢測(cè)到酚類化合物，第5天時(shí)檢測(cè)到2 種化合物，之后不再發(fā)生變化；其余種類化合物在發(fā)酵過程中基本保持不變。

圖1 魚露不同發(fā)酵時(shí)間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類（A）和組成（B）Fig. 1 Total number of volatile flavor compounds in fish sauce at different fermentation time points (A) and number of volatile flavor compounds in different chemical classes (B)

2.3 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物的聚類分析熱圖

發(fā)酵過程為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成提供了豐富的酶和各種前體物質(zhì)，如碳水化合物、游離氨基酸和脂肪酸等[23]。為了進(jìn)一步研究在發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化，本研究選取在發(fā)酵過程中檢測(cè)到的含量變化較為突出的23 種化合物，對(duì)含量的變化進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，維生素A醛、赤霉素、蓖麻油酸、2,5,8,11,14-五氧雜-16-十六烷醇這4 種化合物在發(fā)酵過程中含量的變化始終比較明顯，可能是這4 種化合物對(duì)魚露的風(fēng)味有著重要的影響。維生素A醛在發(fā)酵前期變化最大，到發(fā)酵后期變化稍有減慢，但總體增加還是比較大的。赤霉素在發(fā)酵的后期含量變化最大，在發(fā)酵前期含量不斷增加，但增加的速度可能稍慢于后期。蓖麻油酸和2,5,8,11,14-五氧雜-16-十六烷醇在整個(gè)發(fā)酵過程中的含量不斷增加，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中增加的速度變化較小。其他化合物在發(fā)酵過程中的含量也在不斷增加，但可能增加的速度與這4 種化合物相比較為緩慢。

圖2 魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物含量變化的聚類分析熱圖Fig. 2 Heat map showing cluster analysis of volatile compounds contents during fish sauce fermentation

2.4 不同種類魚露揮發(fā)性化合物的PCA

PCA將原始變量重新組合成一組新的獨(dú)立綜合變量，同時(shí)根據(jù)實(shí)際需要提取較少的變量，盡可能地反映原始變量[24]。魚露揮發(fā)性化合物通過HS-SPME-GC×GCMS檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)，通過SIMCA軟件進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖3所示。在發(fā)酵的0～15 d，PCA中樣品聚集在一起，說明在發(fā)酵的前15 d，樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分比較接近。到第20天時(shí)，樣品與第15天時(shí)可以明顯地區(qū)分開，說明發(fā)酵到第20天時(shí)魚露的風(fēng)味已經(jīng)發(fā)生改變，到后期魚露樣品的揮發(fā)性風(fēng)味化合物都能夠區(qū)分開，說明魚露風(fēng)味化合物在后期發(fā)酵過程中不斷地發(fā)生改變，通過后期不斷地發(fā)酵才形成了魚露獨(dú)特的風(fēng)味口感。

2.5 魚露揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成分析

通過對(duì)魚露揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成的分析發(fā)現(xiàn)，魚露的風(fēng)味主要是醇類、酸類、酯類和烴類這幾種化合物共同作用的結(jié)果，其中酯類化合物所占比例最高。

醛可以通過多不飽和脂肪酸在微生物和酶的作用下氧化降解形成[25]。這些揮發(fā)性物質(zhì)中的大多數(shù)具有高閾值和令人愉快的氣味，例如草味、麥芽味、水果味和奶酪味[26-27]，它們可以增強(qiáng)食物的整體風(fēng)味。在醛類化合物中，維生素A醛的含量最高，在整個(gè)反應(yīng)的過程中，含量呈先增加后下降的趨勢(shì)，但總體含量增加。苯甲醛是由氨基酸的Strecker反應(yīng)產(chǎn)生[22]，具有令人愉悅的堅(jiān)果香味、水果香味和杏仁香味，是烤花生中的主要羰基化合物[28]，也是水產(chǎn)品中的一種特征風(fēng)味化合物。壬醛被證實(shí)是魚腥味的主體[29]，普遍存在于淡水魚中。發(fā)酵過后，其含量有所降低，說明發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)可以降低魚露的魚腥味。

醇類化合物主要是由脂肪氧化、氨基酸和碳水化合物的代謝產(chǎn)生[30]。醇類化合物的閾值高，對(duì)魚露整體風(fēng)味貢獻(xiàn)小，但一些不飽和醇的閾值低，對(duì)魚露的整體特征風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)。在發(fā)酵的前期，醇類化合物種類較多。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，可能一些化合物因?yàn)榘l(fā)生反應(yīng)而被分解，所以發(fā)酵后期，醇類化合物的種類和含量都有所下降。

酸類化合物的產(chǎn)生主要是脂肪酸甘油三酯發(fā)生氧化或者水解所產(chǎn)生[31]。酸類揮發(fā)性物質(zhì)大多閾值高，因此對(duì)主體風(fēng)味的貢獻(xiàn)值不大，在發(fā)酵過程中，酸類化合物的總量稍有上升，但變化不顯著。

酯類主要來自魚露發(fā)酵過程中酸與醇的酯化反應(yīng)，乙酯主要與魚露發(fā)酵產(chǎn)生的高濃度乙醇有關(guān)，其中乙酸乙酯的含量最高[32-33]。含氮化合物主要來源于美拉德反應(yīng)，或氨基酸的分解作用。吡嗪和呋喃類化合物雖然含量較少，但因?yàn)殚撝档停軌虍a(chǎn)生一定的青草味或豆香味[22]。烷烴類化合物被認(rèn)為是不具有氣味活性的，主要來自于烷氧自由基的裂解，但某些烯烴在一定條件下產(chǎn)生醛和酮類物質(zhì)，對(duì)魚露的整體風(fēng)味產(chǎn)生一定的影響[11]。

3 結(jié) 論

采用HS-SPME-GC×GC-MS技術(shù)，對(duì)魚露發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其發(fā)酵過程中變化較明顯的化合物進(jìn)行對(duì)比分析，共檢測(cè)出化合物116 種，分別為醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、烴類、雜環(huán)、酚類、苯環(huán)類。不同時(shí)間段檢測(cè)魚露揮發(fā)性風(fēng)味化合物差異較明顯。在發(fā)酵過程中檢測(cè)到的化合物種類不斷增加，到后期稍有下降。魚露風(fēng)味化合物含量最多的是酯類化合物。

對(duì)檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在魚露發(fā)酵的前期其氣味成分相差不大，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到第20天時(shí)，揮發(fā)性風(fēng)味化合物成分可以被顯著地區(qū)分開，說明魚露的主要風(fēng)味成分在發(fā)酵后期形成。