單細胞轉錄組測序技術在類風濕性關節(jié)炎的研究進展

李瓊 陳宇婷 接力剛 毋靜 杜紅延

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是常見的自身免疫性疾病，主要累及四肢小關節(jié)，造成關節(jié)破壞和畸形、喪失勞動力甚至危及生命［1，2］。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)RA 發(fā)病率約為0.5%～1.0%，在我國約為0.4%，患者超過500 萬［1，3］。患者的關節(jié)滑膜中存在多種免疫細胞和成纖維細胞，其中特定細胞亞群介導的免疫反應失調(diào)可能在RA 發(fā)病機制中起重要作用。

單細胞轉錄組測序（single cell RNA sequence，sc RNA-seq）能夠從單個細胞分辨率下為人們展示細胞在各種環(huán)境下的狀態(tài)以及功能，打破以往利用有限的細胞標記物對細胞異質性研究的局限性［4，5］?；趕c RNA-seq 的“人類細胞圖譜”項目的開展也將加深對人體組織中處于不同分化或疾病狀態(tài)細胞的理解［6］。這項技術在RA 的應用也為鑒定組織中浸潤性免疫細胞亞群和致病性駐留細胞亞群，以及揭示疾病機制提供有力工具。本文將對sc RNA-seq 技術原理、常用的測序平臺以及在RA中的研究進展進行綜述。

1 單細胞轉錄組測序（sc RNA-seq）技術

sc RNA-seq 的一般流程包括單細胞懸液的制備、細胞捕獲及裂解、逆轉錄及cDNA 擴增、文庫構建及測序等，其中關鍵的兩個步驟為細胞捕獲與分子定量。細胞捕獲最常用的方法是利用微孔、微流或者微滴的技術；而定量主要有基于全長或者標簽兩種方法：前者獲取每個轉錄本覆蓋度一致且獨特的全長片段；后者則是通過標簽探針，捕獲RNA 的5’或3’端序列進行定性定量分析［7］。

2009年湯富酬團隊首次報道了sc RNA-seq［8］，后又出現(xiàn)如Smart-seq2、MARS-seq、CEL-seq、Drop-seq、inDrop 和10X Chromium 等技術。其中Smartseq2 可得到全長的mRNA 序列，而MARS-seq、CEL-seq、Drop-seq、inDrop 和10X Chromium 是將標簽整合到cDNA 中［9］。不同的方法在原理以及靈敏度上有所差異，故應該結合具體的生物學問題選擇最適合的平臺。而Smart-seq2 的主要優(yōu)勢在于可以得到的mRNA 全長信息［5，10］。

sc RNA-seq 數(shù)據(jù)在細胞層面的分析主要包括細胞聚類和細胞軌跡推測，前者通過降維、無監(jiān)督聚類的算法對基因表達相似的細胞進行分群；而后者則是使用最小生成樹的策略，對細胞進行排序，模擬出細胞的分化軌跡。在基因層面的分析主要包括分析差異基因表達、鑒定細胞標記、結合時間軌跡分析基因表達的變化情況、以及分析基因共表達模塊和調(diào)控網(wǎng)絡等［11］。此外，測序數(shù)據(jù)還可以結合單細胞甲基化、染色質的可及性以及表面蛋白等數(shù)據(jù)共同分析，為疾病機制研究提供更加全面的策略［12］。

2 常用測序平臺

目前研究常用的平臺包括基于微滴的in-Drop［13］、Drop-seq［14］、10x Genomics［15］、基于微孔的BD Rhapsody［16］等高通量平臺，以及基于微流的C1 system（Fluidigm）［17］平臺等。InDrop、Drop-seq 和10x Genomics 均將細胞與微球包裹在微液滴中，用微球上獨特的條形碼區(qū)分細胞。這些平臺的主要差異在于條形碼的使用數(shù)量和微球的物理特性，如Drop-seq 比inDrop 的條形碼更多，可以處理更多的細胞，但缺點是細胞捕獲效率低（約1%）。而in-Drop 和10x Genomics 平臺的微球由水凝膠構成，捕獲效率更高（前者約10%；后者約50%）［18］。10x Genomics 還可同時實現(xiàn)單細胞表面蛋白測定［19］和TCR/BCR 測序［20］。BD Rhapsody 平臺在微孔中收集細胞，細胞溶解后釋放的mRNA 與細胞標記結合，同時系統(tǒng)還使用UMI 序列標記mRNA，以減少擴增偏差；可以實現(xiàn)靶向測序，降低實驗成本［9］；可以結合BD AbSeq assays 同時分析轉錄組和蛋白質，為細胞分群提供更可靠的依據(jù)［16］。C1 system（Fluidigm）則是將單個細胞分配到各自反應室，通過顯微鏡來區(qū)分細胞狀態(tài)，計算捕獲細胞的數(shù)量，然后對細胞進行裂解、RNA 逆轉錄和預擴增以及后續(xù)測序分析，其優(yōu)勢在于可以得到全長mRNA 的信息，但捕獲細胞數(shù)量少、成本高且周期長［17］。

3 sc RNA-seq在類風濕關節(jié)炎研究中的應用

3.1 繪制滑膜組織細胞圖譜

高通量sc RNA-seq 為細胞圖譜的建立奠定了技術基礎，已發(fā)表的來自小鼠和健康人群各種組織的細胞圖譜也為進一步研究病理組織中的細胞提供了包括細胞標記物和細胞功能在內(nèi)的理論依據(jù)［21-22］。隨著sc RNA-seq 在RA 中的廣泛應用，對滑膜細胞功能與狀態(tài)的理解也更加深入。2018年，Stephenson 等［23］開發(fā)了一種低成本的微流控技術，對RA 患者膝關節(jié)滑膜組織中的細胞進行了Drop-Seq，利用無監(jiān)督聚類的算法，結合細胞特異性標記物，將20387 個細胞細分成了包括3 種成纖維細胞、3 種T 細胞、NK 細胞等在內(nèi)的13 個細胞亞群，首次展現(xiàn)出一個全面的滑膜組織細胞圖譜。Zhang 等［24］利用流式細胞分選技術將CD4+T 細胞、B 細胞、單核細胞和成纖維細胞分選出來分別進行CEL-Seq2，并整合RNA-seq 得到的數(shù)據(jù)，確定并闡述了4 種成纖維細胞亞群、4 種單核細胞亞群、3 種CD4+T 細胞亞群、3 種CD8+T 細胞亞群和4 種B 細胞亞型的特征。研究者進一步對與疾病相關的基因如炎癥反應和干擾素基因等在每群細胞的差異或公共表達進行了分析，為尋找疾病干預靶點提供了思路。

3.2 鑒定關鍵細胞亞群

在針對疾病不同特征如持續(xù)的炎癥以及關節(jié)的破壞等發(fā)生機制的研究中，將sc RNA-seq 技術應用于關注的細胞群體也可以幫助研究者尋找靶向性更高的治療方式。為了分析成纖維細胞的異質性，Mizoguchi 等［25］對RA 和骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者滑膜組織的成纖維細胞進行了Smart-Seq2，結合表面蛋白的結果，確定了在RA 中顯著擴增的成纖維細胞亞群。這群細胞定位在滑膜的血管周圍，基因功能分析也揭示了其在免疫細胞募集和破骨細胞形成上的潛在作用。在針對巨噬細胞的研究中，Kuo 等［26］報道了HBEGF+炎癥巨噬細胞，這群細胞顯著表達促進炎癥反應的基因NR4A3、PLAUR 和CXCL2，以 及 生 長 因 子HBEGF 和EREG，而對該群巨噬細胞-成纖維細胞作用軸的干擾也成為RA 治療的新方向。Stephan 等［27］證實了分化的CX3CR1+巨噬細胞的存在，這群細胞表達Trem2 和Vsig4 等免疫基因，并可以在滑膜襯里形成一個內(nèi)部免疫屏障，抑制關節(jié)的炎癥反應。此外，為了鑒定出能夠分化為破骨細胞的亞群，研究者分選了CX3CR1hiLy6Cint細胞，在BD Rhapsody 平臺進行了測序，發(fā)現(xiàn)了由Foxm1 因子調(diào)節(jié)的具有破骨細胞特征的細胞群體，也證實了Foxm1 具有調(diào)控特定巨噬細胞向破骨細胞分化的作用［28］。

3.3 單細胞多組學應用

單細胞多組學測序可以通過優(yōu)化和整合基因組、表觀遺傳、轉錄組和蛋白質組提供的不同數(shù)據(jù)，全面分析單個細胞的獨特基因型、表型以及潛在的調(diào)控機制［29］。在RA 中，單細胞多組學的應用集中于轉錄組和蛋白組。在一項鑒定RA 中擴增CD4+T細胞克隆的定性和定量的特征的研究中，Ishigaki等［30］對RA 患者和健康人的外周血中的CD4+T 細胞進行了單細胞TCR 分析，并對外周血與滑膜中顯著擴增的CD4+T 細胞克隆進行了sc RNA seq 分析，由此追蹤同一克隆內(nèi)基因表達的變化。此外，為了分析并驗證更加穩(wěn)定的細胞分群，轉錄組數(shù)據(jù)可以結合bulk RNA-seq 以及單細胞表面蛋白的數(shù)據(jù)。比如在鑒定RA 患者中驅動炎癥的細胞亞群時，可以利用典型相關性分析算法整合bulk RNAseq 和sc RNA-seq 數(shù)據(jù)，同時應用質譜流式細胞技術進行分群與驗證［24］。既往研究已經(jīng)表明DNA 的甲基化和組蛋白修飾等是RA 發(fā)病的關鍵因素，因此未來對單細胞表觀遺傳和轉錄組的綜合分析也將有助于理解RA 的調(diào)控機制［31］。

3.4 sc RNA-seq 數(shù)據(jù)挖掘

基于sc RNA-seq 的數(shù)據(jù)挖掘已經(jīng)廣泛應用于腫瘤的研究，幫助研究者發(fā)現(xiàn)新的思路或驗證假說［32］。RA 的數(shù)據(jù)挖掘也已逐漸開展，Gawel 等［33］對關節(jié)炎小鼠模型的關節(jié)和淋巴結的sc RNA-seq 數(shù)據(jù)進行了系統(tǒng)性分析，發(fā)現(xiàn)信號通路、潛在的生物標記物以及藥物靶點等在各種細胞類型中存在差異，并構建了疾病相關細胞類型和相互作用的網(wǎng)絡模型，用于系統(tǒng)性地分析可靠的生物標記物和藥物。在一項驗證外周血與關節(jié)炎癥反應存在差異的meta 分析中，研究者也補充了sc RNA-seq 的數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)了血液和關節(jié)中共存的4 種細胞群炎癥反應表達譜的差異，為假設提供了更多的支持證據(jù)［34］?；谕瑯拥乃悸?，Lewis 等［35］完善了免疫途徑在各種細胞亞群差異性激活的研究。進一步的分析提示W(wǎng)NT、TGF-β、FcεRI 以及ERBB 信號通路對成纖維細胞的轉變起到調(diào)節(jié)作用，而這些變化的通路則可能為兩種疾病的治療提供方向［36］。

4 總結與展望

Sc RNA-seq 測序除了有助于鑒定細胞亞群，還可預測細胞在疾病進展中的分化狀態(tài)。目前已經(jīng)成功對不同階段OA 患者的軟骨細胞進行測序和擬時間軌跡分析，揭示了疾病不同階段的基因表達譜變化，這提示在有關RA 的研究中也可以根據(jù)患者的不同發(fā)病階段分析基因表達譜的改變，尋找可能的干預靶點［37］。此外單細胞空間轉錄組的出現(xiàn)也可以在不丟失細胞空間信息的前提下研究細胞與微環(huán)境的相互作用，識別不同細胞群在其空間背景下的特定功能［38］。因此，隨著sc RNA-seq 技術的完善以及在RA 中的廣泛應用對骨膜組織內(nèi)的細胞狀態(tài)的研究將更加深入。且結合單細胞多組學以及空間轉錄組的信息，可從基因、表觀遺傳、轉錄組、蛋白組以及組織微環(huán)境層面全面分析RA 的發(fā)病機制，為疾病分期、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和確定疾病早期診斷標記物提供理論依據(jù)。