酶法合成亞麻酸磷脂的結構特性及抗氧化性

肖志剛，楊國強，楊慶余，王麗爽，張雪萍，郭世龍，李 哲，楊 舒,2,

（1.沈陽師范大學糧食學院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽大學生命科學與工程學院，遼寧 沈陽 110034）

牡丹籽油是一種天然植物油脂，已經正式成為我國的新資源食用油品種之一[1]。在牡丹籽油中，亞麻酸含量高達50%以上，亞麻酸的含量高于大宗食用油，其與亞麻籽油的含量基本相近[2-4]。亞麻酸在人體內可代謝生成DPA和DHA，同時它也是構成細胞膜和生物酶的基礎物質，能夠提高機體免疫力，在抗氧化、降血脂、降血糖、提高腦神經功能、緩解視疲勞、降血壓、減肥等方面具有重要作用。目前，對牡丹籽油的研究主要集中于提取工藝、脂肪酸組成分析、油脂穩定性及影響因素、功能評價等方面，在一些食品領域的應用還尚未開發[5-9]。

大豆磷脂（soybean phospholipid，SP）是生物膜的一種基本成分，而且對機體的正常代謝有重要的調節功能，它被廣泛應用于醫藥、食品、飼料、化妝等行業，這是由磷脂的多種功能特性決定的，比如抗氧化、乳化、潤濕等，SP的生理活性與其脂肪酸組成和極性末端的組成密切相關[10-13]。有關研究表明脂肪酸與磷脂經酶催化發生酯化反應，得到改性磷脂，其理化性質和生物活性較原磷脂均有不同程度改變，可有效提高脂肪酸在體內的吸收與利用程度[14-17]。Ghosh等[18]采用微生物脂肪酶催化癸酸、月桂酸、豆蔻酸及亞麻酸甲酯與卵磷脂發生酯交換反應，卵磷脂改性后其表面活性增強，從而使磷脂具有更好的應用價值。

有研究表明亞麻酸磷脂（linolenic acid phospholipid,LNA-P）對人與動物的肝功能具有保護作用，它能調節膽固醇在人體內的含量、有效降低膽固醇、高血脂及冠心病的發病率，促進大腦發育與記憶力，能夠作為一種安全性高、無毒副作用的新型天然抗氧化劑[19-21]。Nathalie等[22]以Lipozyme TL IM為催化劑，在正己烷溶劑體系下催化卵磷脂與兩種富含共軛亞麻酸的油脂，即卵磷脂與亞麻籽油異構化濃縮物和石榴籽油發生酯交換反應，以得到富含共軛亞油酸的卵磷脂。袁博等[23]研究發現大豆卵磷脂是一種抗氧化效果優良的天然抗氧化劑。近年來國內外關于改性磷脂的研究已有相關報道，常見用于和磷脂反應的脂肪酸有中長鏈飽和脂肪酸、EPA、DHA、CLA和ARA等[24-25]。但它們研究主要集中在酶催化合成的工藝優化、分離純化等，針對改性磷脂的結構特性與抗氧化活性研究比較少。具有抗氧化能力的食物作為可以保護人體健康的天然抗氧化劑受到大眾越來越多的關注，因此對食物含有的抗氧化活性物質及抗氧化能力進行檢測和鑒定具有重要意義[26]。鑒于以上方面，由于牡丹籽油中亞麻酸含量達到50%以上，將牡丹籽油與SP經酶催化進行酯交換反應，有利于提高亞麻酸的結合率，同時能夠發揮亞麻酸的生理功效。

為此，本實驗以Lipozyme RM IM酶作為催化劑，SP與牡丹籽油為原料，通過添加不同含量的酶制備得到亞麻酸含量不同的LNA-P，采用氣相色譜、紅外光譜、差示掃描量熱儀及X射線衍射等分析儀器進行結構表征和分析，并比較SP與LNA-P清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基、羥自由基的能力進行研究，以期為SP的抗氧化性開發與研究提供理論基礎與依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SP（≥90%） 沈陽天峰生物工程技術有限公司；牡丹籽油 菏澤中禾健元生物科技有限公司；Lipozyme RM IM酶 諾維信（中國）有限公司；DPPH、ABTS＋抗氧化活性測試試劑盒 阿拉丁試劑（上海）有限公司；正己烷 天津市科密歐化學試劑有限公司；丙酮、無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GC-2014C氣相色譜儀 北京北分華譜分析儀器技術有限公司；UV-9000型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SHA-C恒溫振蕩培養箱 常州國華電器有限公司；AL104-IC電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；HH-6A數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 上海漢諾儀器有限公司；MODEL J-E多用途高效離心機 貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo公司；Q20型差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司；Ultima IV型X射線衍射儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 LNA-P的制備方法

將SP與牡丹籽油按1∶4質量比混合均勻置于20 mL的玻璃瓶中，然后分別加入占體系質量分數4%、6%、8%、12%的酶和2 mL正己烷，所制備得到的樣品分別編號LNA-P-1、LNA-P-2、LNA-P-3、LNA-P-4。置于50 ℃恒溫水浴振蕩培養搖床中，以200 r/min的速率振蕩16 h后，待酯化反應結束后低速4 000 r/min離心10 min，回收固定化酶，重復離心2 次，以便最大限度除去反應酶，混合液50 ℃旋轉蒸發，除去溶劑。反應后的混合液加入3 倍體積的冷丙酮（0 ℃）洗滌，攪拌10 min后4 000 r/min離心，以洗脫游離的脂肪酸，直至取少量上清液于潔凈的玻璃片上，快速揮干后無油漬為止，所得固形物經氮氣吹干即得到LNA-P，并保存于冰箱以備用。

1.3.2 磷脂中亞麻酸含量的測定

甲酯化：取樣品約30～50 mg于10 mL試管中，加入0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液2 mL，置于70 ℃恒溫水浴鍋中反應約10 min，反應過程不時振蕩，至磷脂溶解，冷卻2 min，然后加入1 mL BF3-甲醇溶液，置于70 ℃恒溫水浴鍋中反應5 min，使甲酯化完全[27]。然后冷卻，加入2 mL正己烷，經過渦旋振蕩器振蕩，以促進磷脂在正己烷中的溶解。然后吸取上層正己烷相溶液，待用。

樣品經甲酯化后用氣相色譜進行脂肪酸分析。氣相色譜檢測條件：色譜柱HB-88（30 m×0.25 mm，0.2 μm）。升溫程序：60 ℃保持5 min，然后20 ℃/min升至210 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min升溫至240 ℃，保持2 min。載氣為N2，流量1.1 mL/min，壓力0.5 MPa；燃氣為H2，流量40 mL/min，壓力0.25 MPa；助燃氣為空氣，流量400 mL/min，壓力0.5 MPa；柱前壓20 psi；分流比30∶1；進樣量1 μL；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃。計算采用面積歸一化法，合成率計算公式如下：

1.3.3 紅外光譜分析

稱取少量樣品，利用KBr壓片，通過Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀測定，測定參數：分辨率為4 cm－1，每個樣品掃描32 次，選取掃描波長500～4 000 cm－1進行分析。

1.3.4 X射線衍射分析方法

取適量的樣品進行X射線衍射分析，測量的工作參數為：采用Cu-Kα靶、石墨單色器、40 kV和40 mA，及反發射狹縫為10 mm，接受狹縫0.3 mm，掃描速率5 °/min，掃描范圍2θ5°～70°，然后根據布拉格公式：d=λ/2sinθ，計算d值。

1.3.5 差式掃描量熱儀分析方法

采用DSC-Q2差式掃描量熱儀測定。用鋁盒分別稱取4.0～7.0 mg樣品，壓蓋密封，以空鋁盒為對照樣，掃描溫度范圍為100～170 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3.6 抗氧化性分析

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力分析

參照文獻[28]方法。以無水乙醇為溶劑，配制濃度為2×10－4mol/L的DPPH自由基溶液，配制相同質量濃度為20 mg/mL的磷脂樣品溶液，精確吸取2 mL磷脂溶液，加入1 mL DPPH自由基溶液，搖勻后在暗室下放置30 min，在517 nm波長處測定上述溶液的吸光度。按照式（2）計算DPPH自由基清除率，同一測定重復3 次。

式中：A為樣品與DPPH自由基混合溶液的吸光度；A0為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無水乙醇與DPPH自由基混合溶液的吸光度。

1.3.6.2 ABTS陽離子自由基清除能力分析

參照文獻[29]方法。將ABTS及過硫酸鉀用少量水溶解，再以無水乙醇為溶劑配制濃度為7×10－3mol/L的ABTS溶液與濃度為2.5×10－3mol/L的過硫酸鉀溶液，并將二者等體積混合，在暗處放置12 h后取混合溶液稀釋50 倍待用。配制相同質量濃度為20 mg/mL的磷脂樣品溶液，精確吸取2 mL磷脂溶液，加入1 mL ABTS和過硫酸鉀混合溶液，搖勻后于室溫條件下避光30 min。以無水乙醇作為對照，在734 nm波長處分別測定上述溶液的吸光度。按照式（3）計算其清除率，同一測定重復3 次。

式中：A為樣品與ABTS和過硫酸鉀混合溶液的吸光度；A0為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無水乙醇與ABTS和過硫酸鉀混合溶液的吸光度。

1.3.6.3 羥自由基清除能力分析

參照文獻[30]方法。配制1.8 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1.8 mmol/L過氧化氫溶液、1.8 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、配制相同質量濃度為20 mg/mL的磷脂樣品溶液，按順序加入到試管中，振蕩后靜置10 min，以蒸餾水為參比，于510 nm波長處測吸光度，代入式（4）計算清除率，同一測定重復3 次。

式中：Ao為硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇溶液、蒸餾水與過氧化氫混合溶液吸光度；Ai為硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇溶液、樣品液與過氧化氫混合溶液的吸光度；Aj為硫酸亞鐵、蒸餾水、樣品液與過氧化氫混合溶液吸光度。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0對數據進行方差分析，均值之間的顯著差異通過Duncan多重范圍檢驗得到，實驗所得數據經Origin 9.1處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 酶添加量對LNA-P合成率的影響

圖1 SP和LNA-P的氣相色譜圖Fig. 1 GC profiles of SP and LNA-P

圖2 酶添加量對亞麻酸合成率的影響Fig. 2 Effect of enzyme dosage on the synthesis rate of linolenic acid

由圖1可知，酯化前后混合脂肪酸的組成在氣相色譜圖中表現出了明顯的差異，SP經過酯化反應后，可以發現亞麻酸的峰急劇升高。由圖2可知，酶添加量能顯著增強亞麻酸合成率（P＜0.05），隨著加酶量的增加，亞麻酸合成率逐漸上升，以4%、6%、8%、12%的酶添加量分別制備得到合成率為8.4%（LNA-P-1）、13.7%（LNA-P-2）、18.4%（LNA-P-3）、23.4%（LNA-P-4），這是由于酶促反應主要是酶活性基團與底物作用的結果，隨著加酶量的增加，活性基團增加，酶活性的位點不斷增加，加速了酶促反應，杜俊民等[31]以較高純度的亞麻酸乙酯為酰基供體與磷脂進行酯交換反應，隨著脂肪酶量達到最大，其亞麻酸的結合率可達20%，這與本實驗結論一致。說明經Lipozyme RM IM酶催化合成了富含LNA-P。

2.2 分子間化學鍵變化的分析

圖3 SP和LNA-P的紅外圖譜Fig. 3 IR spectra of SP and LNA-P

由圖3可知，在2 916、2 850 cm－1出現的峰是C—H伸縮振動吸收峰；由于SP中具有許多C—H的結構。在1 736、1 462 cm－1，出現的尖峰分別為C＝O的伸縮振動區和—OH彎曲振動吸收峰；而酯交換后的LNA-P在1 736、1 462 cm－1的吸收峰未發生明顯的變化，這說明SP中C＝O和—OH結構未參與反應。在1 235 cm－1和1 175、1 056 cm－1出現的吸收峰分別為C—O與C—O—C的伸縮振動峰，經酯交換反應后LNA-P紅外圖譜中吸收峰位置移到1 223、1 152、1 038 cm－1位置上，說明SP中C—O和C—O—C結構發生酯化反應，亞麻酸進行了取代反應，形成了新的酯[32]。在967、817、711 cm－1出現的吸收峰為C—H的變形振動峰，經酯化反應后吸收峰基本無變化，說明SP的C—H結構未參加反應。表明SP與牡丹籽油發生了酯交換反應，形成了LNA-P。

2.3 晶型結構特征的分析

由圖4可以看出，SP在7.82°、20.47°處附近有明顯的衍射峰，其晶面間距d分別為11.296、4.334 ?，通過酯交換反應后在7.82°、20.47°附近處的特征峰強度顯著消失與降低，這可能是因為酯交換反應過程破壞了原磷脂的結晶區域，形成了新的酯，亞麻酸取代了SP中脂肪酸組成結構，導致在7.82°、20.47°的衍射峰強度消失與降低，SP與LNA-P都在20.47°左右存在衍射峰，沒有呈晶體的趨勢，屬于無定型結構[33]。表明其中的磷脂與牡丹籽油發生酯交換反應，晶型結構被破壞，再重新組合形成LNA-P晶型結構。

圖4 SP和LNA-P的X-衍射圖譜Fig. 4 XRD patterns of SP and LNA-P

2.4 差示掃描量熱儀分析

圖5 SP和LNA-P的差式掃描量熱圖Fig. 5 DSC profiles of SP and LNA-P

由圖5可以看出，SP是一種無定型物質，沒有固定熔融峰，因為SP為混合物，關于其吸熱峰的報道多不一致[34-35]。圖5中LNA-P在DSC曲線上有多處峰的波動，可能是不同組分在不同的溫度條件下表現出不同的熱量變化。LNA-P有一個最大熔融峰，且隨著亞麻酸含量的增加，其熔融峰溫度逐漸升高，酯交換制備得到8.4%、13.7%、18.4%、23.4%的LNA-P熔融峰溫度分別為131.50、137.51、138.91、147.99 ℃。這可能是由于SP和牡丹籽油發生酯化反應后形成了新的酯，SP的相變溫度發生變化，導致其熔融峰的溫度發生了變化，改變了其熱力學性質。

2.5 抗氧化性分析

2.5.1 DPPH自由基清除能力分析

圖6 SP與LNA-P的DPP自由基清除能力Fig. 6 DPPH radical scavenging capacities of SP and LNA-P

由圖6可知，SP與LNA-P清除DPPH自由基能力存在顯著性的差異（P＜0.05），隨著亞麻酸含量的升高，LNA-P對DPPH自由基清除率也逐漸增大，LNA-P-1、LNA-P-2、LNA-P-3、LNA-P-4，對DPPH自由基清除率分別為22.1%、26.1%、33.9%、45.2%。這是由于亞麻酸含量的增多，LNA-P與自由基發生氧化還原反應的能力提高，更有利于捕捉自由基，使得DPPH自由基清除率提高[36-37]。表明LNA-P與SP相比具有更強的DPPH自由基清除能力。

2.5.2 ABTS陽離子自由基清除能力分析

圖7 SP與LNA-P的ABTS陽離子自由基清除能力Fig. 7 ABTS cation radical scavenging abilities of SP and LNA-P

由圖7可以看出，LNA-P對ABTS陽離子自由基的清除率顯著高于SP，LNA-P-1、LNA-P-2、LNA-P-3、LNA-P-4對ABTS陽離子自由基清除率分別為26.7%、29.5%、41.2%、52.2%。這是由于亞麻酸含量提高，LNA-P與ABTS陽離子自由基反應過程中有新的共軛結構生成，更易于捕捉自由基，使得ABTS陽離子自由基的清除率增強[38-39]。說明亞麻酸含量越高，LNA-P清除ABTS陽離子自由基能力越強。

2.5.3 羥自由基清除能力分析

圖8 SP與LNA-P的羥自由基清除能力Fig. 8 Hydroxyl radical scavenging capacities of SP and LNA-P

由圖8可以看出，隨著亞麻酸含量的增加，LNA-P清除羥自由基的能力顯著升高，LNA-P-1、LNA-P-2、LNA-P-3、LNA-P-4，對羥自由基清除率分別為24.6%、37.5%、46.1%、73.4%。這可能由于亞麻酸自身具有一定的抗氧化性，LNA-P與羥自由基發生反應，使得羥基暴露增加，更有利于捕捉自由基，提高了自由基的清除率[40-41]。這表明亞麻酸含量越多，能顯著提高LNA-P對羥自由基清除能力。

3 結 論

通過對脂肪酶Lipozyme RMIM催化合成的LNA-P進行了研究，以氣相色譜測定不同酶添加量下LNA-P的合成率。采用紅外光譜、X射線衍射及差示掃描量熱儀等分析手段對LNA-P進行結構表征，研究LNA-P對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基的清除能力。研究結果表明，SP與牡丹籽油經Lipozyme RM IM酶催化合成LNA-P，酶添加量為4%、6%、8%、12%制備的LNA-P合成率分別為8.4%、13.7%、18.4%、23.4%，磷脂中的C—O與C—O—C鍵的吸收峰位置變化明顯，有典型的酯基特征結構，在差示掃描量熱儀分析中LNA-P的最大熔融峰的溫度呈升高趨勢，在LNA-P合成率為23.4%時，熔融峰溫度達到最大為147.99 ℃，經酯交換反應后LNA-P在7.82°（d=11.296 ?）附近的衍射峰消失與在20.47°（d=4.334 ?）附近的衍射峰的強度降低。這都說明了SP與牡丹籽油發生了酯化反應，改變了SP的結構與組成，形成了LNA-P。在抗氧化性實驗中，亞麻酸結合率越高，LNA-P對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基的清除率越高，LNA-P合成率為23.4%時，對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除率最大達到45.2%、52.2%和73.4%，說明了制備的LNA-P具有較強的抗氧化性能力。綜上所述，由于酶催化發生酯交換反應將亞麻酸結合到SP分子結構上合成LNA-P，SP的結構發生改變，其抗氧化能力顯著提高，為SP的研究提供了有效的基礎，為SP的抗氧化活性提供了有效的理論依據。