pH值處理對黑豆分離蛋白結構、流變特性及乳化性能的影響

曾 琪，胡 淼，王 歡，鐘明明，齊寶坤，江連洲

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑豆是豆科植物大豆的干燥成熟種子[1]，亦稱為馬豆、冬豆子、黑大豆，與普通大豆相比，黑豆蛋白的含量更高，常常被人們稱為“植物蛋白之王”、“豆中之王”。作為一種植物蛋白資源，黑豆分離蛋白（black bean protein isolate，BBPI）來源廣泛，氨基酸構成比例合適，較大豆蛋白更為優越，是優質蛋白資源之一。

隨著社會的發展，人們對食品營養和安全越發重視，對蛋白質的需求量日益增加。蛋白質的乳化性和流變性是食品加工制造過程中需要考慮的重要性質[2]，許多研究發現，pH值處理可以使氨基酸帶電，通過蛋白質與水分子間的離子-偶極相互作用進而改變蛋白質的溶解性，帶同種電荷的蛋白質之間相互排斥導致亞基的解離和結構的展開[3]，蛋白質的溶解性和表面疏水性顯著影響著蛋白質其他功能性質的發揮[4]。目前，關于黑豆的研究主要集中在抗氧化機理及品種之間的營養成分、功能性質差異[5]及產品的研發[6]，有關黑豆蛋白的研究集中于熱處理及超聲處理對黑豆蛋白結構和功能性質的影響[7-8]。較多學者研究pH值處理改變蛋白質性質，主要集中在極端酸堿處理對大豆蛋白、7S、11S的疏水性、溶解性等理化性質及結構的影響[9]或極端pH結合熱處理對大豆分離蛋白結構特性的影響[10]，關于pH值處理對BBPI的表面性質、流變性質及其穩定乳液的相互關系的研究較少，植物蛋白的相互關系的研究可用于乳劑制備、長期穩定性預測和食品質量控制。

本研究采用不同pH值條件處理BBPI后調節回中性條件，研究pH值對蛋白質的功能性質、流變性、乳化性的影響以及與穩定乳液的相互關系，使黑豆的資源能夠得到更好的發掘。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆 北大荒綠野食品有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonicacid，TNBS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸法蛋白含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津博迪化工股份有限公司；正己烷 天津北科化學品有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CR22G高速冷凍離心機、F-4500型熒光分光光度計日本日立公司；PHS-3D pH計 上海雷磁儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；VIC-212電子天平 美國艾科勒公司；Discovery系列HR-1型流變儀 美國TA公司；傅里葉紅外光譜儀美國Nicoler公司。

1.3 方法

1.3.1 制備BBPI

黑豆去皮、烘干、磨粉、過60 目篩，1∶3（g/mL）料液比加入正己烷脫脂，25 ℃攪拌1 h后4 500 r/min離心20 min，重復3 次，沉淀物室溫放置24 h干燥得到脫脂豆粉；參照蔣將等[3]的方法并加以改進，干燥后的脫脂豆粕按1∶10（g/mL）的料液比加入去離子水混合，常溫攪拌30 min，用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至8.0，攪拌1 h后，4 ℃、9 000 r/min離心20 min取上清液，上清液用2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.0，攪拌1 h后，4 ℃，9 000 r/min離心20 min取沉淀物，沉淀物水洗2 次，取沉淀分散于水中，用2 mol/L NaOH溶液調節pH 7.0，冷凍干燥后備用。

1.3.2 pH值處理BBPI

取10 份等量的冷凍干燥后的BBPI粉末溶解于去離子水（1∶5 g/mL）中，25 ℃攪拌1 h，分別用2 mol/L HCl溶液調節pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，或用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，25 ℃攪拌2 h，隨即用2 mol/L NaOH或HCl溶液調節pH 7.0，保持中性條件誘導重折疊1 h，冷凍干燥后置于4 ℃備用。

1.3.3 溶解度

參考Morr等[11]的方法研究BBPI的溶解度隨pH值的變化。將質量分數2.0%的蛋白溶液轉移到15 mL離心管中，4 ℃、9 100 r/min離心10 min，去除不溶性殘渣。上清液梯度稀釋，采用二喹啉甲酸法測定上清液蛋白質含量，溶解度表示為上清液中蛋白質含量與樣品中總蛋白質含量的百分比。

1.3.4 乳化性及乳化穩定性

取質量分數為1%的蛋白溶液15 mL與5 mL葵花籽油混勻，以12 000 r/min高速勻化2 min，形成均一的乳液，第0分鐘時從底部吸取50 μL加入5 mL 0.1%的SDS溶液，用旋渦混合器混勻，靜置30 min后從乳液底部再吸取50 μL加入5 mL 0.1%的SDS溶液，用旋渦混合器混勻，500 nm波長處測其吸光度。乳化性和乳化穩定性分別按式（1）和（2）計算。

式中：T為2.303；N為稀釋倍數；C為形成乳化液之前的蛋白質質量濃度/（g/mL）；θ為乳化液的油相體積分數/%；A0為乳化液均質后第0分鐘時測得的吸光度；A30為乳化液均質后靜置30 min后測得的吸光度；t30－t0為2 次測定的時間差。

1.3.5 傅里葉紅外光譜測定

參照朱明華等[12]的方法，分別取不同pH值處理后凍干的蛋白粉末1 mg，以1∶100的比例加入溴化鉀，研磨均勻，壓片，純溴化鉀為參照，掃描波段400～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描次數32；傅里葉紅外光譜測定的酰胺I帶可以計算BBPI的二級結構含量，使用peakfit軟件擬合出在酰胺-I 區域（1 7 0 0 ～1 6 0 0 c m－1）的峰位，酰胺-I區域對蛋白質的二級結構最為敏感[13]，根據峰的中心位置將其分配到相應的結構中，1 600～1 639 cm－1譜帶歸屬于β-折疊；1 640～1 650 cm－1譜帶歸屬于無規卷曲；1 651～1 660 cm－1譜帶歸屬于α-螺旋；1 661～1 700 cm－1譜帶歸屬于β-轉角[14]。

1.3.6 表面疏水性

參照Kato等[15]的方法稱取一定量蛋白樣品溶于去離子水，稀釋至蛋白質濃度為0.005～0.500 mol/mL，取4 mL不同濃度蛋白樣品加入20 μL 8.0 mmol/L ANS，混勻器混勻，避光靜置15 min測熒光強度，激發波長390 nm，發射波長470 nm，狹縫寬度5 nm。以熒光強度對蛋白濃度作圖，斜率即為該蛋白樣品的表面疏水性。

1.3.7 內源熒光光譜分析

取不同pH值處理后的BBPI樣品溶于去離子水中，蛋白質的最終質量濃度為0.1 mg/mL，采用F-4500型熒光分光光度計測定BBPI的內源性熒光光譜，激發波長為290 nm，發射光的掃描范圍為280～350 nm，狹縫為5 nm，每個樣品溶液掃描3 次。

1.3.8 流變學特性的測定

1.3.8.1 表觀黏度的測定

不同pH值處理后的BBPI樣品的表觀黏度利用馬爾文流變儀進行測定，將各個樣品分別溶解于去離子水中制成質量濃度為200 mg/mL的蛋白溶液，60 mm、0.5°的錐板，實驗在室溫下進行，測定樣品在0.1～100 s－1頻率范圍內的表觀黏度。

1.3.8.2 彈性模量（G’）和黏性模量（G’’）的測定

用流變儀測定蛋白質的振蕩界面膨脹流變特性隨pH值的變化。將蛋白溶液（200 mg/mL）緩慢注入充滿夾具（60 mm，0.5°的錐板）中，室溫保溫5 min，測試參數：振幅值0.3%，剪切頻率0.1～10 Hz，溫度25 ℃，分析樣品分散液的G’、G’’及損耗角正切值（tanδ）隨角頻率的變化。

1.4 數據處理與分析

利用SPSS 18.0對數據進行顯著性及相關性分析，采用Origin 8.0軟件作圖。紅外圖譜數據處理采用Peakfit 4.21軟件進行擬合分析。

2 結果與分析

2.1 溶解性與表面疏水性

圖1 p值對BBPI的溶解性與表面疏水性的影響Fig. 1 Effect of pH on solubility and surface hydrophobicity of BBPI

由圖1可知，BBPI的等電點在pH 4.0～5.0之間，表面疏水性在遠離等電點的兩側均呈現下降趨勢且在等電點附近出現最大值，溶解性在pH 5.0時最低，遠離pH 5.0的兩側時隨酸堿度的增加而增加，這表明在遠離等電點時溶解性與表面疏水性呈負相關，本實驗研究結果與Kato等[15]的研究一致，即溶解性高的蛋白質分子表面存在的疏水性殘基較少。

pH值處理通過改變蛋白質的電離情況進而改變BBPI的溶解度；蛋白質的疏水性殘基大部分位于蛋白質內部，pH值處理后BBPI發生不同程度的變性，蛋白質之間的相互作用改變導致蛋白質的表面疏水性發生改變，隨酸堿度增加，疏水基團暴露增多，當疏水基團增加到一定程度時，蛋白質分子間會通過疏水鍵相互聚集[9]，發生疏水坍塌，從而引起表面疏水性下降。等電點附近表面疏水性出現最高值（pH 3.0）可能是因為蛋白質亞基解離后經過重折疊呈現舒展的狀態，位于α-螺旋內部的疏水氨基酸殘基暴露，導致疏水性增高。

2.2 pH值處理對BBPI熒光強度的分析

圖2 不同p值處理下BBPI的熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of black bean protein isolate under pH treatments

由圖2可以看出，相比于未經pH值處理的BBPI，pH值處理后，BBPI的熒光強度均有所下降且最大吸收波長發生不同程度的紅移，說明pH值處理改變了蛋白質色氨酸殘基的微環境，BBPI色氨酸殘基暴露；由表1可知，BBPI的最大吸收波長（λmax）分布在325～340 nm之間；pH值處理條件下，隨酸處理程度加深，熒光強度從202.6增長到265.4，最大吸收波長從330 nm紅移到332 nm；隨堿處理程度加深，熒光強度從324.6增長到408.2，蛋白質的最大吸收波長從330 nm紅移到333 nm，由此可見，經pH值處理后的蛋白質的色氨酸殘基所處的微環境極性有所提高且堿處理對BBPI影響較大。

表1 不同p值處理下BBPI的熒光強度和最大吸收波長Table 1 Fluoresceine intensity and maximum absorption wavelength of black bean protein isolate under p treatments

表1 不同p值處理下BBPI的熒光強度和最大吸收波長Table 1 Fluoresceine intensity and maximum absorption wavelength of black bean protein isolate under p treatments

pH 未處理 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 λmax/nm 328 332 332 331 330 330 330 330 330 332 333熒光強度 464.9 265.4 232.9 214.9 202.6 302.7 314.6 324.6 337.2 346.2 408.2

λmax與色氨酸殘基所處的環境有關，λmax＜330 nm表示色氨酸殘基位于非極性環境，相反λmax＞330 nm則表示色氨酸殘基位于極性環境，由表1可知，未經pH值處理的BBPI的最大吸收波長為328 nm，表明蛋白質色氨酸殘基仍位于蛋白質內部非極性環境中，而熒光強度為464.9 nm，明顯大于pH值處理后的樣品熒光強度，可能是因為BBPI自身外部的疏水基團較多，所以BBPI的溶解性較差；經pH值處理后蛋白質的色氨酸殘基不同程度的暴露在外部的極性環境中[16]且BBPI的熒光強度隨著pH值處理程度加深而增加，反映了這種結構變化屬于一種動態過程，pH值處理后的蛋白樣品熒光強度低于未處理組，可能是因為BBPI在pH值處理后再調整回pH 7的過程中可能會產生一種處于變性與未變現之間的“熔球態”的蛋白，這種情況下的蛋白質部分折疊，雖然不能恢復到之前的狀態，但蛋白質分子的再聚集會導致更多色氨酸殘基被包裹于更加疏水的分子內部，從而引起內源熒光強度的下降[17]；也可能是因為酸堿環境下蛋白質分子展開，使內部色氨酸殘基暴露，蛋白質分子間相互作用使色氨酸微環境變化，導致內源熒光強度下降[18]。

2.3 pH值處理對BBPI傅里葉紅外光譜分析

表2 酰胺I帶擬合p值處理下BBPI二級結構含量Table 2 Contents of secondary structures of black bean protein isolate under p treatments measured by curve-fitting of amide ? band

表2 酰胺I帶擬合p值處理下BBPI二級結構含量Table 2 Contents of secondary structures of black bean protein isolate under p treatments measured by curve-fitting of amide ? band

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

%pH α-螺旋 β-折疊 β-轉角 無規卷曲未處理 18.44±0.55a 42.58±0.53ab 22.15±0.05de 16.82±0.05d 2 16.18±0.57de 40.18±0.51cd 25.16±0.58ab 18.49±1.03bc 3 15.78±0.56ef 43.79±0.60a 21.26±0.54e 19.16±0.19b 4 15.09±0.05f 42.64±0.52ab 23.24±0.54cd 19.02±0.02bc 5 14.93±0.02f 42.15±1.02b 22.04±1.05de 20.87±0.02a 6 15.52±0.48ef 42.82±0.05ab 22.72±0.50cde 18.92±0.03bc 7 16.31±0.57de 41.71±1.49b 23.13±1.01cd 18.84±0.03bc 8 16.85±0.83cd 41.36±1.32bc 23.27±1.11cd 18.52±0.59bc 9 17.43±0.59bc 39.97±0.72cde 24.31±1.40bc 18.29±0.20c 10 17.92±0.59ab 39.77±0.05de 24.88±1.00ab 17.43±0.60d 11 18.17±0.56ab 38.71±0.57e 26.07±0.80a 17.05±0.48d

由表2可知，BBPI含有4 種二級結構組分：α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲，其中α-螺旋和β-折疊為BBPI的有序結構，β-轉角和無規卷曲為無序結構；與未處理BBPI樣品對比，pH值處理條件下BBPI的α-螺旋結構含量減少，無規卷曲含量增加，可能是因為pH值處理使得BBPI發生部分變性，變性過程與α-螺旋結構數量的減少和無序結構的數量增加有關[19]；在遠離等電點的pH值處理下，α-螺旋含量顯著增加，β-折疊含量顯著下降，且隨著酸堿度的增加，這些變化更加明顯；靠近等電點時，α-螺旋含量減小、β-折疊含量增多，可能是因為蛋白質表面電荷量少，靜電斥力減小、疏水相互作用增大、分子間氫鍵增大導致的[20]，無規卷曲含量的增加可能是受蛋白質聚集的影響。β-折疊比例增加的同時α-螺旋結構的比例減小，可能是因為pH值的變化影響了α-螺旋和β-折疊結構之間的平衡，使其發生了結構轉化[21]。通過與表面疏水性變化規律相關性分析表明，表面疏水性與β-轉角含量負相關（r=－0.423，P＜0.05），表面疏水性與β-折疊含量正相關（r=0.502，P＜0.05），說明蛋白質的二級結構變化影響了其功能性質的表達，王中江等[22]采用圓二色譜研究pH值對大豆分離蛋白二級結構的影響，得到的結果與本研究結果一致。

2.4 pH值處理對BBPI乳化性的分析

如圖3所示，在pH值處理下，BBPI的乳化性及乳化穩定性呈現先下降后上升的趨勢，等電點附近乳化性及乳化穩定性最低，可能是因為等電點時，蛋白質表面電荷量少，缺乏靜電排斥的相互作用會使得乳液中蛋白質絮凝、聚集導致乳化性降低，偏離等電點時，蛋白質表面靜電荷含量增加，增加了蛋白質的溶解性進而提高蛋白質的乳化活性及乳化穩定性，隨酸堿度增加，蛋白質逐漸變性，變性蛋白所含氨基酸殘基的疏水基團指向油相，而親水性基團指向水，越偏離等電點乳化活性越好，可能是因為蛋白質發生了改性，增強了與油相之間的作用，乳化活性更好[23]。

圖3 p值對BBPI乳化性及乳化穩定性的影響Fig. 3 Effect of pH on EAI and ESI of BBPI

pH值處理可能會使得BBPI部分形成“熔融態”的蛋白質[24]，這部分蛋白的二級結構相對穩定，但三級結構會有所變化，結構展開會導致蛋白內部疏水氨基酸暴露，表面疏水性增強，蛋白質三級結構的改變顯著提高了蛋白質的乳化性能[24]，結構展開使得蛋白質具有相對柔軟的構象，多肽鏈松散，乳化性能提高[25]。

2.5 pH值處理對BBPI流變學特性的分析

2.5.1 表觀黏度

圖4 p值對BBPI表觀黏度的影響Fig. 4 Effect of pH on apparent viscosity of BBPI

由圖4可知，在同一剪切速率下，不同pH條件處理后BBPI溶液的表觀黏度不同，pH值處理后的蛋白質溶液的表觀黏度大于未處理組，說明處理后的蛋白體系趨于穩定[26]；不同pH條件處理的蛋白溶液樣品間表觀黏度值和變化趨勢差異較大，等電點時的表觀黏度最低，所有樣品的表觀黏度隨剪切速率的增加均呈現降低的趨勢，即表現出剪切稀釋的現象，符合非牛頓流體特性，這與Karaman等[27]報道的乳液剪切稀化一致。

表觀黏度的變化規律與乳化活性及乳化穩定性大體一致，即遠離等電點均呈現上升趨勢。在pH 3時表觀黏度大于pH 2條件下的蛋白溶液，可能是因為該條件處理BBPI導致疏水基團暴露較多，蛋白間形成了三維網狀結構，降低了流動性，即蛋白質分子之間的連接更加緊密，表觀黏度增大[28-29]。表觀黏度呈現上升的趨勢且在等電點時最小，這與孫少敏等[30]報道的小麥醇溶蛋白溶液的研究一致，這是因為臨近等電點，水合度小，溶液流動時受到的阻力小，故在pH 4、5時黏度較小；遠離等電點時溶解性高，水化程度比較高，能固定更多的水分子，體積變大，根據托克斯定律[31]，蛋白溶液體積越大，溶液在流動的過程中受到的內部阻力越大，阻礙了介質的自由移動從而表現出較高的表觀黏度，所以表觀黏度呈上升趨勢[32]；尤其當pH值過于偏酸偏堿時，蛋白質發生部分變性，削弱了表面水合層蛋白質分子間發生聚集形成較大的聚合物，很大程度上提高了蛋白質溶液的黏度[33]。也可能是因為遠離等電點，蛋白質表面帶同種電荷量增加，靜電斥力增加導致黏度增加[33]。

2.5.2 BBPI黏彈性

圖5 p值對BBPI的G’、G’’的影響Fig. 5 Effect of pH on G’ and G’’ of BBPI

由于蛋白質發生凝膠的能力與聚集狀態有很大的關系，所以蛋白質在不同的pH值處理條件發生的不同聚集模式可能對蛋白質的凝膠能力有很大的影響，小幅振蕩變形流變測試已經被廣泛用于研究蛋白凝膠過程中的黏彈性和分子間相互作用。由圖5可以看出，儲能模量對掃描頻率具有一定的依賴性，pH值處理后的樣品G’值高于未處理組，說明pH值處理BBPI可以在一定程度上促進形成均一、致密、高強度的蛋白質凝膠狀網絡結構[34]，pH值處理后的樣品的G’增大，原因可能是pH值處理后蛋白質中的亞基發生變性，巰基氧化形成二硫鍵，新的二硫鍵進一步加強了蛋白質分子間的共價作用，加固了蛋白的凝膠網絡結構，G’增強[35]；pH 4.0、5.0時G’、G’’增長緩慢可能是因為臨近等電點時，蛋白質水合能力差，蛋白質重排變得困難，降低了G’增長的速度，蛋白質發生聚集生成沉淀不能產生凝膠，黏彈性較差。pH 11.0樣品的G’和G’’低，可能是因為蛋白質變性結構展開，有序結構向無序結構轉變導致流動性增加，這有可能破壞已經形成的網絡結構，所以G’下降[35]；也可能是極端pH值條件下破壞了疏水相互作用力和范德華力，使蛋白亞基之間的二硫鍵發生斷裂，蛋白質的三級結構部分展開，從而改變了蛋白質緊密的三維結構，黏彈性減弱。不同pH值處理后樣品的G’增幅差異較大，說明pH值對蛋白形成凝膠網絡狀結構有很大的影響。

圖6 p值對BBPI的tanδ的影響Fig. 6 Effect of pH on tanδ of BBPI

tanδ值可以作為衡量蛋白質在凝膠三維網狀結構中的動態性質。由圖6可知，未處理組、pH 2.0、4.0、5.0、11.0的BBPI溶液tanδ＞1且呈上升趨勢，說明蛋白溶液體系的聚合度變小，形成的凝膠狀的網絡結構不夠穩定，可能在高剪切頻率下，破壞了已經形成的三維結構。pH值處于等電點時tanδ值大，說明蛋白質的G’’性強，流動性大，不利于形成凝膠狀網絡結構[36]。pH 3.0時tanδ＜1且隨頻率增加有所上升，表明pH 3的條件顯著提高BBPI的黏彈性[37]。pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的蛋白溶液的tanδ＜1且從低剪切頻率到高剪切頻率幾乎不變，表明在這個范圍內蛋白質的凝膠網絡結構黏性越低，彈性越高，tanδ值越低表明形成的三維網狀結構更好[38]，說明在6＜pH＜10范圍內pH值處理使得蛋白在溶液中的彈性更強，結構更穩定，可能是疏水相互作用在穩定蛋白質-蛋白質聚集物方面發揮重要作用。對比表面疏水性數據發現，表面疏水性強的BBPI樣品溶液形成的三維網狀結構更好。

3 結 論

pH值處理對BBPI的理化性質及流變性質產生了一定的影響，遠離等電點隨pH值升高，蛋白質間的疏水作用降低，減少了靜電粒子的相互作用，溶解性得到改善，具有高溶解性蛋白質的表面疏水性較低；三級結構展開，亞基解離，巰基氧化成二硫鍵可以進一步加強蛋白質的凝膠網絡結構，疏水氨基酸暴露影響蛋白質分子空間結構，表面活性增強，溶解性和乳化性隨之增強，蛋白質的二級結構發生了由β-折疊向α-螺旋的轉變，表面疏水性與β-折疊含量正相關（r=0.502，P＜0.05），溶解度與乳化性變化趨勢一致，與表面疏水性變化趨勢相反。

隨pH值處理條件變化，表觀黏度先減少后增大，pH值處理后BBPI乳液的黏彈性均高于未處理組，表面疏水性對形成凝膠狀的網絡結構發揮重要作用；研究發現制備乳液時具有高溶解性和低疏水性（pH 11.0）的蛋白質能更好的與油水界面結合，乳化活性與穩定性最好；具有高溶解性和高疏水性（pH 3.0）的蛋白質能形成強黏彈性界面膜，且表面疏水性越高，形成的三維網狀結構更好。