冬瓜和節瓜疫病的離體葉片接種方法研究

曾莉莎 陳康麗 呂順 王芳 吳永官 杜彩嫻 唐琪璐 黃熊娟 莫安妮 黎炎

摘要：【目的】評估離體葉片接種法對冬瓜疫病抗性鑒定的可行性，建立一種快速高效的冬瓜疫病抗性鑒定方法，并篩選抗疫病的冬瓜和節瓜品種，為培育及利用抗病品種提供參考。【方法】以注射灌根接種法為對照，采用離體葉片接種法對9份冬瓜品種進行抗病性鑒定和比較，評估離體葉片接種法的可行性;并采用所建立的離體葉片接種法對 23份冬瓜品種和18份節瓜品種進行抗病性鑒定，從中篩選抗、耐疫病的冬瓜和節瓜品種。【結果】離體葉片接種后，發病癥狀主要表現為葉片呈現暗綠色水漬狀病斑，后期變成黑色病斑，有的會長出白色霉層。9份供試冬瓜品種中，鐵柱168、B184和P33等7份冬瓜品種分別采用兩種方法進行抗感性評價，反應類型結果完全一致。兩種鑒定方法對冬瓜疫病的抗性鑒定結果一致性高達77.78%：注射灌根接種法發病率的平均值是54.6%，病情指數的平均值是29.6;離體葉片接種法發病率的平均值是60.2%，病情指數的平均值是31.5。對兩種接種法的發病率和病情指數進行相關性分析，結果表明注射灌根接種法和離體葉片接種法的相關性達極顯著水平（P<0.01），兩種接種方法的發病率與病情指數相關系數分別為0.953和0.993。節瓜普遍比冬瓜更抗疫病，初步篩選出3份高抗冬瓜品種，分別是連環雜交大冬瓜、鐵心999黑皮冬瓜和黑娃四號小冬瓜，病情指數分別為5.9、9.2和1.7;5份高抗節瓜品種，分別是佳慶338節瓜、玲瓏節瓜、翠秀節瓜、新粵農8號和5號黑毛節瓜，病情指數分別為4.2、5.0、5.8、6.7和7.5。【結論】與注射灌根法相比，離體葉片接種法具有發病癥狀明顯、操作方便、速度快、不傷害植物等優點，離體葉片接種法可作為冬瓜品種疫病抗病性鑒定的輔助手段，用離體葉片接種法篩選出3份高抗冬瓜品種和5份高抗節瓜品種可作為培育及利用抗病品種的資源。

關鍵詞： 冬瓜;節瓜;疫病;離體葉片接種法;抗病品種

中圖分類號：S642.304.3? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2213-07

In vitro leaves inoculation method for wax gourd and chieh-qua

ZENG Li-sha1， CHEN Kang-li1， LYU Shun1*， WANG Fang1， WU Yong-guan2，

DU Cai-xian1， TANG Qi-lu1， HUANG Xiong-juan2， MO An-ni3， LI Yan2

（1Dongguan Banana and Vegetable Institute， Dongguan， Guangdong? 523061， China; 2Vegetable Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China; 3Bureau of Agriculture， Forestry and Water Resources of Xiegang District of Dongguan， Dongguan， Guangdong? 523590， China）

Abstract：【Objective】To evaluate the feasibility of in vitro leaves inoculation method and establish a rapid and efficient method for the identification of wax gourd[Benincasa hispida（Thund.）] Phytophthora blight resistance， and then screen the wax gourd and chieh-qua（B. hispida var.chieh-qua） varieties that resistant to Phytophthora blight， which provided references for breeding and utilization of disease-resistant varieties. 【Method】The disease resistance of nine varie-ties of wax gourd were identified and compared by in vitro leaves inoculation and with injection irrigation root inoculation method as control. The feasibility of in vitro leaves inoculation method was evaluated. Moreover， 23 varieties of wax gourd and 18 varieties of chieh-qua were identified for disease resistance through in vitro leaves inoculation， from which disease-resistant wax gourd and chieh-qua varieties were screened out. 【Result】The disease symptoms after in vitro leaves inoculation were dark-green watermark on the leaves at initial stage， which turned into black spot at the later period， and some would develop white fungal mycelium. Among the nine wax gourd varieties tested， seven varieties had the same reaction type results by the two inoculation methods， such as Tiezhu 168， B184 and P33， etc. The two identification methods had the same disease resistance identification results of 77.78%? on wax gourd varieties. The mean values of disease incidence and disease index of injection irrigation root inoculation were 54.6% and 29.6， respectively. The mean values of disease incidence and disease index of in vitro leaves inoculation were 60.2% and 31.5 respectively. Correlation analysis was performed on the incidence and disease index of the two inoculation methods， and the correlation between the two methods reached extremely significant level（P<0.01）. The correlation coefficient between incidence and disease index of injection irrigation root inoculation and in vitro leaves inoculation were 0.953 and 0.993. Chieh-qua was generally more resistant to Phytophthora blight than wax gourd. Three disease-resistant wax gourd varieties were preliminarily screened out， which were Lianhuanzajiao wax gourd， Tiexin 999 black wax gourd and Heiwa 4 small wax gourd， with the disease indexes of? 5.9，9.2 and 1.7 respectively. Five disease-resistant chieh-qua varieties were selected out， including Jiaqing 338 chieh-qua， Linglong chieh-qua， Cuixiu chieh-qua， Xinyuenong 8 chieh-qua and No.5 black? chieh-qua， with the disease indexes of 4.2， 5.0， 5.8， 6.7 and 7.5， respectively. 【Conclusion】Compared with injection irrigation root inocu-lation，in vitro leaves inoculation method has the advantages of obvious symptoms， convenient operation， fast speed， and no harm to plants， etc.， which can be used as an auxiliary method for disease resistance identification of wax gourd varie-ties. Three wax gourd varieties and five chieh-qua varieties with high disease resistance can be used as disease-resistant resources for breeding and utilizing.

Key words： wax gourd[Benincasa hispida（Thunb.）];chieh-qua（Benincasa hispida var.chieh-qua）;Phytophthora blight; in vitro leaves inoculation method; disease-resistant varieties

Foundation item： Guangxi Science and Technology Major Project（Guike AA17204026，Guike AA17204039）; Dongguan Social Science and Technology Development Key Project（20200507101163）

0 引言

【研究意義】冬瓜[Benincasa hispida（Thunb.） Cogn]和節瓜（B. hispida var. chieh-qua）因產量高、耐貯運、易栽培及貨架期長等優點，深受種植戶的喜愛，現已成為調節市場均衡供應的主要蔬菜品種和農產品加工的理想原料，特別是廣西、廣東、湖南、臺灣和海南等省（區）已形成較大的種植規模（焦賢賢，2018;姚金曉和楊飛，2018;張朝明，2018）。隨著冬瓜和節瓜種植面積的擴大和種植指數的提高，疫病的發生也進一步加劇，尤其在高溫多雨的華南地區發病尤為嚴重，造成產地大量減產，甚至絕收（陸少峰等，2007）。冬瓜和節瓜疫病是由鞭毛菌亞門真菌疫霉菌（Phytophthora de Bary）侵染所致的一種土傳性病害（李衛民等，2007;吳永官等，2012），篩選并選育抗病品種是有效且常用的防治疫病的方法之一，而抗病品系的發掘和利用是培育抗病品種的重要環節，建立一套準確、實用的人工接種抗病性鑒定方法，可加快抗病育種進程。【前人研究進展】鄧麗君等（2015）采用離體葉片接種法和活體接種法對甜瓜白粉病進行抗病性鑒定，發現兩者鑒定結果基本一致，說明離體葉片接種法可用于甜瓜白粉病生理小種的鑒別和抗源鑒定。朱麗梅等（2015）采用自然病圃法和離體葉片接種法分別對茄子早疫病進行抗病性鑒定比較，鑒定結果基本一致，說明離體葉片菌絲塊接種法可作為茄子早疫病抗病性鑒定的輔助手段。劉淼等（2017）報道，用離體葉片接種法和下胚軸傷口接種法對大豆疫霉根腐病進行抗病性鑒定，結果表明兩種方法呈極顯著相關，且差異不顯著，證明采用離體葉片接種法進行大豆疫霉根腐病抗性鑒定同樣準確可行。李智軍等（2007）、彭鐵成等（2012）、孫葉爍等（2019）、孫玉燕等（2019）、徐成翠等（2019）均研究發現離體葉片接種法與活體接種法的鑒定結果相關性非常高，說明離體葉片接種法可用于比較不同作物品種間的抗病性差異。【本研究切入點】冬瓜和節瓜疫病的抗性鑒定和評價常用方法是活體接種法，如注射灌根接種法（謝大森等，2010）。但活體接種法受溫度和濕度等外界環境因素的影響較大，容易對植株造成傷害，耗材也大。前人研究（鄧麗君等，2015;劉淼等，2017）表明離體葉片接種法具有取材簡便、不損害植株、快速、可室內進行等優點。但目前尚未見關于冬瓜和節瓜疫病離體葉片接種法研究的文獻報道。【擬解決的關鍵問題】分別采用離體葉片接種法和注射灌根接種法對9份冬瓜品種進行抗病性鑒定，通過分析兩種方法的鑒定結果探討葉片接種法的可行性;同時，利用離體葉片接種法對23份冬瓜品種和18份節瓜品種進行抗疫病性鑒定評價，從中篩選抗（耐）疫病冬瓜和節瓜品種。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

冬瓜疫病病原菌株（DGYm-1）由廣東省農業科學院蔬菜研究所謝大森研究員提供，目前保存在東莞市香蕉蔬菜研究所實驗室，經鑒定為瓜類疫霉（Phytophthora melonis）。供鑒定的冬瓜品種包括收集自全國各地的23份冬瓜品種和18份節瓜品種，其中冬瓜品種P33、B184、S9和B214種質資源由廣東省農業科學院蔬菜研究所贈送。2017年8月10日全部供試品種定植于東莞市香蕉蔬菜研究所試驗地，按照常規栽培管理方式進行種植管理。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌種培養 將冬瓜疫霉病菌菌株取邊長為20 cm的正方形接種于2%的胡蘿卜瓊脂培養基后，于25 ℃暗培養7 d。活體接種前3 d，用蒸餾水浸沒培養基上的菌絲誘導游動孢子的形成，接種濃度為1000 CFU/mL。

1. 2. 2 離體葉片接種法 在冬（節）瓜的始果期，于2017年9月25日選取無病蟲斑、大小基本一致的鮮嫩葉片，蒸餾水洗凈后浸泡15 min，用滅菌吸水紙吸干葉片表面的水分后，將葉片正面朝上排放于置有雙層滅菌紗布的不銹鋼碟中，每個碟放置1片，每份品種3次重復，加蒸餾水使紗布濕透，備用。把準備好的菌餅移入瓷碟中的葉片，每葉片放置4個菌餅，放置位點與葉片主脈位置一致，菌餅有菌絲的那面緊貼在葉片背面，以只放置無菌瓊脂塊的葉片處理為對照，用透明封口袋將碟子密封確保其濕潤度，28 ℃光照培養下恒溫培養，促使病害發生，接種后每隔12 h加水一次，并觀察葉片變化情況。接種3 d后調查發病情況，觀看發病病斑的大小，取3次重復的平均值。抗感級別評價標準參考王長林和沈鏑（2008）對冬瓜和節瓜疫病的分級標準;病情分級標準參考朱麗梅等（2015）對茄子早疫病分級標準，根據材料冬瓜葉片的面積與特征稍做調整，結果如表1。

1. 2. 3 注射灌根接種法 選擇23份冬瓜品種中在華南地區主栽培的品種，包括鐵柱168、B184、P33、綠寶極早熟冬瓜、B214、莞研1號小冬瓜、小家碧玉小冬瓜、S9和鐵心999黑皮冬瓜等9份冬瓜品種，采用注射灌根接種法進行抗病鑒定試驗，用于驗證比較其與離體葉片接種法的可行性。選取長勢健壯、大小基本一致的冬瓜幼苗，于幼苗3片真葉平展時接種，在植株根莖部約3 cm處的土壤中扎3 cm左右孔，注入5 mL瓜類疫霉病菌孢子懸浮液。接種溫度22～25 ℃，用無色塑料膜保濕24 h。保濕的植株置于白天25 ℃左右、夜晚18 ℃左右的溫室內正常管理。每份材料處理100株，3次重復。接種后7 d調查發病情況，記錄發病株數及病級。病情分級標準與抗感級別評價標準參考王長林和沈鏑（2008）對冬瓜疫病的分級標準。

1. 3 統計分析

試驗數據采用SPSS 19.0進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 離體葉片接種后發病癥狀

從接種后第3 d開始觀察記錄，致病力測定所接種的23份冬瓜品種及18份節瓜品種均有不同程度的發病，發病癥狀主要表現在植株葉片呈現暗綠色水漬狀病斑，后期變成黑色病斑，有的會長出白色霉層，且病斑擴散速度較快。從41份供試材料中選取6份不同抗感病程度的冬瓜和節瓜品種，包括感病品種黑元帥冬瓜、抗病品種一炮沖天冬瓜、中抗品種B214冬瓜、抗病品種廣優1號節瓜、抗病品種P33冬瓜和高抗品種5號黑毛節瓜，其發病癥狀如圖1所示。

2. 2 2種接種方法對不同冬瓜品種的抗性鑒定結果

從表2可知，9份供試冬瓜品種中，鐵柱168、B184、P33、綠寶極早熟冬瓜、B214、莞研1號小冬瓜和小家碧玉小冬瓜等7份冬瓜品種分別采用兩種方法進行抗感性評價的反應類型結果完全一致，可見注射灌根接種法與離體葉片接種法對冬瓜疫病的抗性鑒定結果一致性高達77.78%。鐵心999黑皮冬瓜由注射灌根接種法鑒定為抗病品種（病情指數11.4），由離體葉片接種法鑒定結果為高抗品種（病情指數9.2）;S9由注射灌根接種法鑒定結果為抗病品種（病情指數33.6），由離體葉片接種法鑒定結果為中抗品種（病情指數37.1）。從表3可知，對9份冬瓜品種的發病率和病情指數進行相關分析，2種接種方法的發病率和病情指數均達極顯著相關水平（P<0.01），相關系數分別為0.953和0.993。注射灌根接種法發病率的平均值是54.6%，病情指數的平均值是29.6;離體葉片接種法發病率的平均值是60.2%，病情指數的平均值是31.5。可見注射灌根接種法的發病率和病情指數的平均值略低于離體葉片接種法。

2. 3 離體葉片接種法對不同冬瓜和節瓜品種的抗性鑒定

從表5可知，離體葉片接種法對23份冬瓜品種的抗性鑒定結果差異相對較大，且大多數不同冬瓜品種間的抗病性存在顯著差異（P<0.05）。其中，13.0%的冬瓜品種表現高抗，34.8%的冬瓜品種表現抗病，43.5%的冬瓜品種表現中抗，8.7%的冬瓜品種表現感病。抗性為高抗的冬瓜品種包括連環雜交大冬瓜、鐵心999黑皮冬瓜和黑娃四號小冬瓜，其病情指數分別為5.9、9.2和1.7。從表6可看出，離體葉片接種法對18份節瓜品種的抗性鑒定結果差異相對較小，27.8%的節瓜品種表現高抗，50.0%的節瓜品種表現抗病，22.2%的節瓜品種表現中抗。抗性為高抗的5份節瓜品種是佳慶338節瓜、玲瓏節瓜、翠秀節瓜、新粵農8號和5號黑毛節瓜，其病情指數分別為4.2、5.0、5.8、6.7和7.5。綜合表5和表6可知，冬瓜品種平均發病率達61.2%，平均病情指數達31.5;節瓜品種平均發病率達52.2%，平均病情指數達23.2。可見冬瓜的發病率與病情指數的平均值略高于節瓜。上述結果表明相對冬瓜品種而言，節瓜普遍比較抗病。

3 討論

冬瓜和節瓜疫病是土傳病害，病菌隨病殘體在土壤或糞肥中越冬，借灌水、氣流、風雨等進行傳播蔓延（戴子武和周火強，2010），加上華南地區常年高溫多雨且濕度大，極易導致冬瓜和節瓜疫病的爆發（程亮，2017）。目前在生產上防治冬瓜和節瓜疫病以化學防治為主，且用藥單一（向欣葉等，2016）。大量重復使用化學藥劑不僅導致病菌抗藥性變異體的出現而使防效降低，還增加生產成本并加劇污染環境（陸少峰等，2007）。因此，選育抗病品種是目前防治冬瓜和節瓜疫病最為經濟且有效的方法之一。開展抗病育種工作，育種工作者除需了解抗病機制和抗感病遺傳外，還需要掌握一批抗病基因的種質資源。因此，研究并建立一種高效、快速的冬瓜和節瓜抗病性鑒定方法是縮短育種周期、提高育種效率的關鍵和基礎（王彥杰等，2004）。目前，自然病圃法或苗期接種法是抗病品種鑒定較為可靠的方法，但自然病圃法是一個耗時的方法，通常要2個月以上才表現癥狀，且土壤中病原分布不均勻會造成較大誤差。苗期接種法雖然能縮短時間，但還需要創造合適的溫濕度等環境條件，離體葉片接種法比苗期接種法減少了育苗與等待接種結果的時間。與注射灌根接種法相比，離體葉片接種法具有操作方便，發病速度快，不易受不可控環境因素的影響等優點。

本研究首次利用離體葉片接種法對冬瓜疫病進行抗病性鑒定，通過與注射灌根法的鑒定結果對比分析，探討離體葉片接種法的可行性。結果表明兩種鑒定方法對77.78%的冬瓜品種抗病性鑒定結果一致，且兩種方法的相關性達極顯著水平，發病率與病情指數的相關系數分別為0.953和0.993，說明離體葉片接種法能用于區分不同冬瓜品種對疫病的抗病性，離體葉片接種法可作為冬瓜抗疫病品種快速鑒定及篩選的輔助手段。此結果與鄧麗君等（2015）、劉淼等（2017）、徐成翠等（2019）的研究結論相似。與注射灌根接種法相比，離體葉片接種法的發病率與病情指數平均值均略高，這可能與葉片比幼苗更容易感染及擴散病菌有關，從而導致葉片的平均發病率與平均病情級數略高于幼苗。此外，葉片是植株可再生的器官，且數量多，同一植株可做多次重復。故與注射灌根接種法相比，離體葉片接種法具有發病癥狀明顯，不傷害植株，單株可重復性等優點。

通過本研究建立的離體葉片接種法，對23份冬瓜品種和18份節瓜品種進行抗病性初步鑒定，結果發現冬瓜的平均發病率與病情指數略高于節瓜，可能與葉片的茸毛有關。節瓜普遍葉片兩面均有茸毛，且數量多。而多數冬瓜葉表面有稀疏的柔毛，葉背有粗硬毛，相較節瓜而言較少。植物身上的茸毛是一種防御武器，一定程度上可以抵御病蟲害侵害，不同的生理結構導致節瓜普遍比冬瓜抗病。本研究初步篩選出連環雜交大冬瓜、鐵心999黑皮冬瓜、黑娃四號黑皮小冬瓜、佳慶338節瓜、玲瓏節瓜、翠秀節瓜、新粵農8號節瓜和5號黑毛節瓜等8份高抗疫病的冬（節）瓜品種，以及廣東黑皮、佳慶鐵心冬瓜、綠寶極早熟冬瓜、翠甜節瓜等14份中抗病的冬（節）瓜品種，可為廣東省冬（節）瓜抗病品種資源的篩選評價提供依據，也為利用不同抗病冬瓜和節瓜品種進行合理布局（搭配種植）提供參考。但本研究只是基于離體葉片接種對部分本地主栽冬瓜和節瓜品種的抗病性進行初步鑒定，接下來還需開展更廣泛、更深入的盆栽及田間抗病性評價試驗，進一步明確不同冬瓜和節瓜品種的抗感病情況。此外，可結合瓜類疫霉菌的平板計數法或熒光定量檢測技術，開展不同接種葉片上瓜類疫霉菌的數量測定，進一步驗證此方法的可行性。

4 結論

與注射灌根法相比，離體葉片接種法具有發病癥狀明顯、操作方便、速度快、不傷害植物等優點，離體葉片接種法可作為冬瓜品種疫病抗病性鑒定的輔助手段，用離體葉片接種法篩選出3份高抗冬瓜品種和5份高抗節瓜品種可作為培育及利用抗病品種的資源。

參考文獻：

程亮. 2017. 廣西瓜類疫病菌對烯酰嗎啉的抗藥性研究[D]. 南寧：廣西大學. [Cheng L. 2017. Studies the resistance of phytophthora spp from cucurbit crop blight to dimethomirphin Guanxi[D]. Nanning： Guangxi University.]

戴子武，周火強. 2010. 冬瓜疫病的發生因素與防治技術研究[J]. 蔬菜，（5）： 19-21. [Dai Z W， Zhou H Q. 2010. Research on the occurrence factors and control techniques of wax gourd blight[J]. Vegetables，（5）： 19-21.]

鄧麗君，廖新福，王惠林，戶金鴿，楊軍，楊咪. 2015. 甜瓜白粉病離體葉片接種方法研究[J]. 中國瓜菜，28（3）： 18-21. [Deng L J，Liao X F，Wang H L，Hu J G，Yang J，Yang M. 2015. Research of detached leaf inoculation for powdery mildew of melon[J]. China Cucurbits and Vegetables，28（3）： 18-21.]

焦賢賢. 2018. 冬瓜核心種質的構建[D]. 南寧：廣西大學. [Jiao X X. 2018. Construction of core collections of max gourd[D]. Nanning： Guangxi University.]

李衛民，晏衛紅，黃思良，陸少峰，陳景成，岑貞陸，付崗. 2007. 廣西黑皮冬瓜疫病的病原菌鑒定及其生物學特性[J]. 植物病理學報，（3）：333-336. [Li W M，Yan W H，Huang S L，Lu S F，Chen J C，Cen Z L，Fu G. 2007. Identification and biological characteristics of the causal organism of Phytophthora disease in Guangxi[J]. Acta Phytopathologica Sinica，（3）：333-336.]

李智軍，龍衛平，鄭錦榮，雷建軍. 2007. 辣椒疫病抗性離體葉鑒定法研究[J]. 華南農業大學學報，28（2）： 47-51. [Li Z J，Long W P，Zheng J R，Lei J J. 2007. In vitro leaf technique for the evaluation of pepper resistance to Phytophthora capsici[J]. Journal of South China Agricultural University，28（2）： 47-51.]

劉淼，來永才，李煒，畢影東，劉明，徐鵬飛，李琬，王玲，邸樹峰，丁俊男. 2017. 離體葉片接種法鑒定大豆疫霉根腐病抗病性[J]. 安徽農業科學，45（11）： 43-46. [Liu M，Lai Y C，Li W，Bi Y D，Liu M，Xu P F，Li W，Wang L，Di S F，Ding J N. 2017. Resistance identification of soybean sources to Phytophthora root rot by leaf inoculation method[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，45（11）： 43-46.]

陸少峰，吳永官，黃思良，李立志. 2007. 冬瓜疫病防治研究進展[J]. 中國農學通報，23（11）： 301-304. [Lu S F，Wu Y G，Huang S L，Li L Z. 2007. Research progress in control of wax gourd phytophthora blight[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，23（11）： 301-304.]

彭鐵成，陳云云，羅靜瑤，謝俊，湯華. 2012. 香蕉枯萎病的離體葉片接種技術研究[J]. 廣東農業科學，（10）： 7-9. [Peng T C，Chen Y Y，Luo J Y，Xie J，Tang H. 2012. Research on in vitro leaves inoculation technique for banana Fusa-rium Wilt Disease[J]. Guangdong Agricultural Sciences，（10）： 7-9.]

孫葉爍，郝玲玉，張杰，張魯剛. 2019. 大白菜菌核病抗性鑒定方法研究[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），47（12）： 123-129. [Sun Y S，Hao L Y，Zhang J，Zhang L G. 2019. Identification method of resistance to Sclerotinia in Chinese cabbage[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），47（12）： 123-129.]