2株廣西豬源H9N2亞型流感病毒遺傳進化及生物學特性分析

孔子榮 李三木 何奇松 曾詠芳 楊可妍 馮淑萍 孫翔翔 熊毅 顏健華

摘要：【目的】明確廣西豬源H9N2亞型流感病毒的遺傳特征及分子生物學特性（抗原性、耐藥性和致病性），為廣西豬源H9N2亞型流感病毒的防控提供科學依據。【方法】以分離自廣西百色地區的2株豬源H9N2亞型流感病毒（SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株）為研究對象，運用RT-PCR擴增其全基因組的8個基因片段（HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因），經克隆測序后進行核苷酸序列及氨基酸位點分析?！窘Y果】2株廣西豬源H9N2亞型流感病毒的核苷酸序列開放閱讀框（ORF）分別是PB2：2280 bp、PB1：2274 bp、PA：2151 bp、HA：1683 bp、NP：1497 bp、NA：1410 bp、M：982 bp和NS：838 bp。2株廣西豬源H9N2亞型流感病毒全基因組僅M基因核苷酸序列與豬源H9N2亞型流感病毒的相似性較高，而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均與禽源H9N2亞型流感病毒的相似性較高，在基因型分類上屬于G57基因型，為我國廣泛流行的H9N2亞型基因型。2株廣西豬源H9N2亞型流感病毒的HA蛋白發生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突變，NA蛋白抗原決定簇S331V、W403S和Q431K也發生突變;NA蛋白在N2亞型的耐藥性關鍵位點119E、151D、292R、276E和294N位點未發生突變，但在NA蛋白抗原區存在S331V、K367E和Q432K突變，且M2氨基酸位點發生S31N突變。2株廣西豬源H9N2亞型流感病毒HA蛋白連接HA1和HA2的氨基酸均為RSSR↓GLF;HA蛋白存在1個因P315S突變而新增的潛在糖基化位點（NCS）;NA蛋白未缺失NA潛在糖基化位點，也未出現NA蛋白頸部桿狀結構63～65 aa缺失現象，在NA潛在糖基化位點中69、86、146、200和234 aa處非常保守，但發生W402S突變?！窘Y論】從廣西百色分離獲得的2株豬源H9N2亞型流感病毒（SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株）雖為低致病力毒株，但在流感病毒基因重組過程中發揮重要作用，且其致病性有增強趨勢，已對金剛烷胺類藥物產生耐藥性。因此，應加強廣西地區哺乳動物H9N2亞型流感病毒的監控，并警惕其跨種間傳播。

關鍵詞： 豬流感病毒;H9N2亞型;基因重組;抗原性;耐藥性;致病性

中圖分類號： S852.659.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2304-07

Genetic evolution and biological characteristics analysis of two strains of H9N2 subtype influenza virus from swine in Guangxi

KONG Zi-rong1， LI San-mu2，HE Qi-song3， ZENG Yong-fang1， YANG Ke-yan1，

FENG Shu-ping3， SUN Xiang-xiang1， XIONG Yi3， YAN Jian-hua2*

（1College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2Medical College，Guangxi University， Nanning? 530004， China; 3Guangxi Center for Animal Disease Prevention and Control， Nanning? 530001，China）

Abstract：【Objective】To understand the genetic and molecular biological characteristics（antigenicity， drug resistance and pathogenicity） of pig H9N2 subtype influenza virus from swine in Guangxi and to provide scientific basis for the prevention and control of swine H9N2 influenza virus in Guangxi. 【Method】 Two strains of pig H9N2 subtype influenza virus from swine isolated from Baise in Guangxi（SW/GX/P2/2011 and SW/GX/P3/2011） were used as materials， eight segments（HA， NA， NP， M， NS， PB1， PB2 and PA） of both virus strains? whole genome were amplified by RT-PCR. After cloning and sequencing， the nucleotide sequence and amino acid sites were analyzed. 【Result】Nucleotide sequence open reading frame（ORF） of two strains of H9N2 influenza virus isolated from pigs were PB2：2280 bp， PB1：2274 bp， PA：2151 bp， HA：1683 bp， NP：1497 bp， NA：1410 bp， M：982 bp and NS：838 bp， respectively. In genomes of the two isolated strains，only the nucleotide sequence of M gene of the two isolates had high similarity with H9N2 subtype influenza virus of swine origin， while the nucleotide sequences of HA，NA，NP，NS，PA，PB2 and PB1 genes had high similarity with H9N2 subtype influenza virus of avian origin， and belonged to G57 genotype in genotype classification， which was the H9N2 subtype genotype widely prevalent in China. Mutations of R180Q， T213A， D216E， M224I， N285S and V287T occurred in HA protein of the two isolated strains， and the NA protein antigenic determinants S331V， W403S and Q431K were also mutated. In the drug resistance locus analysis， the isolated virus strains did not mutate at the 119E， 151D， 292R， 276E and 294N sites of the NA protein in the N2 subtype resistance，but S331V， K367E and Q432K mutations were found in the antigen region of NA protein，and the M2 amino acid site produced S31N mutations.The amino acids connec-ting HA1 and HA2 of the two isolates were RSSR↓GLF. A new potential glycosylation site（NCS） existed in HA protein due to P315S mutation. There was no deletion of NA potential glycosylation site and 63-65 aa deletion in the neck rod structure of NA protein. Among the potential glycosylation sites of NA，69，86，146，200 and 234 aa were very conservative， but W402S mutation occurred. 【Conclusion】The two H9N2 influenza viruses（SW/GX/P2/2011 and SW/ GX/P3/2011） isolated from Baise， Guangxi are low virulence strains， but they play an important role in the gene recombination of influenza viruses， and their pathogenicity tends to increase. They have developed amantadine resistance. Therefore， it is necessary to strengthen the surveillance of H9N2 subtype influenza virus in mammals in Guangxi， and to guard against its cross species transmission.

Key words： swine influenza virus; H9N2 subtype; genetic recombination; antigenicity; drug resistance; pathogenicity

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31660713）; Guangxi Natural Science Foundation（2015GXNSFEA139002）

0 引言

【研究意義】豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）隸屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒屬，主要引發豬群發生呼吸道疾病（汪琪等，2017;李鴿等，2019）。豬是流感病毒進化過程中的混合器，能將禽源、豬源和人源的不同亞型流感病毒基因進行重組（李海燕等，2004;蘭德松等，2018;汪琪等，2018）。H9N2亞型是一種極易跨越種間屏障的流感病毒亞型（Butt et al.，2005），若在豬群中與其他亞型流感病毒不斷重組或重配，極有可能產生感染人類的新型流感病毒。因此，加強豬源H9N2亞型流感病毒流行監測對整個流感病毒防控體系的建設和完善具有重要意義。【前人研究進展】李海燕等（2004）研究發現，我國豬群中存在H9N2亞型SIV，且證實豬只充當禽源、豬源和人源流感病毒重組的混合器。H9N2亞型流感病毒能為H5N1亞型、H7N9亞型和H5N6亞型等感染人類的流感病毒提供內部基因，是一個極其危險的信號（Gu et al.，2014）。陳建新等（2011）研究表明，H9N2亞型SIV不僅能感染小鼠，還在小鼠體內表現出較強的致病性，與HA蛋白裂解位點顯示的低致病性不一致，其原因可能是流感病毒在哺乳動物體內與在家禽體內的致病機理不一致。伍和明等（2012）對廣西豬源H9N2亞型流感病毒全基因組序列進行分析，結果發現分離病毒株具備較強的跨種屬傳播能力。殷斌等（2015）對1株山東H9N2亞型SIV進行遺傳進化分析，發現該毒株是禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）向豬體適應的毒株。劉曉敏等（2017）成功建立了禽源H9N2亞型SIV反向遺傳操作技術平臺，為后續開展SIV的基因功能研究打下基礎。孫王楊吉等（2019）對1株浙江H9N2亞型SIV進行遺傳進化和致病性分析，結果表明豬可能是AIV獲得感染哺乳動物能力的過渡宿主。Sun等（2019）于2017—2018年從華南地區的家禽中分離獲得8株H9N2亞型流感病毒，通過系統發育進化樹及生物學特性分析，發現H9N2亞型流感病毒向哺乳動物傳播的能力不斷增強。此外，Samir等（2019）通過對埃及的家養雞群進行樣品采集，并選取5種亞型毒株進行測序及HA基因進化分析，結果發現HA基因與亞洲G1系的親緣關系較近，且各基因片段在不斷進化或重組?！颈狙芯壳腥朦c】至今，有關廣西地區豬源H9N2亞型流感病毒的研究報道較少，尤其在遺傳特征研究及生物學特性分析方面更少?！緮M解決的關鍵問題】對分離自廣西百色地區的2株豬源H9N2亞型流感病毒進行遺傳進化分析，并通過關鍵位點分析了解其抗原性、耐藥性及致病性，為廣西豬源H9N2亞型流感病毒的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

豬源H9N2亞型流感病毒SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株均分離自廣西百色市樂業縣送檢的病豬組織樣品，由廣西動物疫病預防控制中心分離鑒定并保存。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司;病毒核酸抽提、膠回收和質粒提取試劑盒及DL2000 DNA Marker等購自天根生化科技（北京）有限公司;M-MLV反轉錄酶、抑制降解酶（RRI）、Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體及大腸桿菌DH5α感受態細胞等購自寶生物工程（大連）有限公司。

1. 2 引物設計與合成

參考Hoffmann等（2001）擴增A型流感病毒基因組的引物設計原則，利用Primer 5.0設計8對引物用于擴增廣西豬源H9N2亞型流感病毒基因組各片段（表1）。所有引物均委托寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 RT-PCR擴增

以接種SPF雞胚增殖獲得的病毒尿囊液抽提病毒總RNA，并以此為模板進行RT-PCR擴增。RT-PCR反應體系25.0 μL：2×Step Bufffer 10.0 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNA模板5.0 μL， RNase Free dH2O補足至25.0 μL。擴增程序：42 ℃反轉錄1 h;94 ℃預變性5 min;94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 4 目的條帶回收與克隆

按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進行DNA目的片段回收純化，將回收純化獲得的DNA目的片段與pMD18-T載體連接，經轉化和涂板后挑斑進行重組質粒鑒定，陽性重組質粒送至寶生物工程（大連）有限公司測序。

1. 5 病毒基因組測序分析

利用SeqMan進行序列拼接以獲得完整的病毒基因組序列，再使用MEGA 5.0繪制毒株遺傳進化樹并分析相關功能位點。

2 結果與分析

2. 1 豬源H9N2亞型流感病毒各基因片段擴增結果

利用設計的特異性引物進行RT-PCR擴增，電泳檢測獲得的目的條帶分別為HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因（圖1），與預期結果一致，說明廣西豬源H9N2亞型流感病毒SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株全基因組各片段均擴增成功。

2. 2 豬源H9N2亞型流感病毒基因核苷酸序列比對及遺傳進化分析結果

廣西豬源H9N2亞型流感病毒SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株經基因克隆測序得到的核苷酸序列開放閱讀框（ORF）分別是PB2：2280 bp、PB1：2274 bp、PA：2151 bp、HA：1683 bp、NP：1497 bp、NA：1410 bp、M：982 bp和NS：838 bp。使用NCBI中的BLAST進行比對分析，獲得與2株廣西豬源H9N2亞型流感病毒各基因片段核苷酸序列相似性最高的參考毒株（表2）。利用MEGA 5.0對SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株的各基因片段進行遺傳進化分析，其中，基于HA基因核苷酸序列的遺傳進化分析顯示這2株豬源H9N2亞型流感病毒與A/duck/Hong Kong/Y280/97株屬于同一分支（圖2），為BJ/94系中的Y280亞系;基于NA基因核苷酸序列的遺傳進化分析顯示這2株豬源H9N2亞型流感病毒與A/chicken/Hong Kong/G9/97株屬于同一分支，為BJ/94系中的G9/97亞系;基于NS基因核苷酸序列的遺傳進化分析顯示這2株豬源H9N2亞型流感病毒與A/chicken/Shanghai/F/98株屬于同一分支，為BJ/94系中的F/98亞系;基于PB1、PA和NP基因核苷酸序列的遺傳進化分析均顯示這2株豬源H9N2亞型流感病毒屬于F/98亞系;基于PB2基因核苷酸序列的遺傳進化分析顯示這2株豬源H9N2亞型流感病毒與A/duck/Shantou/2102/2000株屬于同一分支，屬于DK1系;基于M基因核苷酸序列的遺傳進化分析顯示這2株豬源H9N2亞型流感病毒與A/quail/Hong Kong/G1/97株屬同一分支，屬G1/97系。由于SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株的基因組成與目前廣泛流行的G57基因型（圖3）相一致，故確定廣西豬源H9N2亞型流感病毒為G57基因型。

2. 3 豬源H9N2亞型流感病毒表面蛋白抗原性分析結果

SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株與參考株DK/HK/Y280/97、DK/HK/Y439/97和QA/HK/G1/97的HA抗原表位比對分析結果顯示，7個抗原區在147～153 aa、162～167 aa和267～273 aa等3個抗原位區上保守，除此之外有7個抗原位點發生變異，分別是117～181 aa區的R180Q、195～205 aa區的T/E198A、211～227 aa區的T213A、D216E和M/V224L及284～289 aa區的N285S和V287T。以疫苗株SH/F/98、CK/HK/G9/97和QA/HK/G1/97為參考，進行豬源H9N2亞型流感病毒NA抗原性位點比對分析，結果發現在抗原決定簇發生S331V、W403S和Q431K突變，且在紅細胞結合位點發現K367E、D399G、W403S和Q432K存在明顯變異。NA酶活性位點分析結果表明，2株豬源H9N2亞型流感病毒在NA蛋白基質結合位點（118R、224R、243D、277E、350K和425E）上與參考毒株無差異。由此推測，SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株的表面蛋白抗原性已發生改變。

2. 4 豬源H9N2亞型流感病毒耐藥性分析結果

通過對比N2亞型抗神經氨酸酶抑制劑NA蛋白酶活性位點氨基酸序列，結果顯示SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株在119E、151D、292R、276E和294N位點均未發生突變，說明廣西豬源H9N2亞型流感病毒對神經氨酸酶抑制劑不具耐藥性;但在NA蛋白抗原區發生S331V、K367E和Q432K突變，而這些突變可能會影響病毒的耐藥性;M2氨基酸位點分析發現其氨基酸序列發生S31N突變，說明廣西豬源H9N2亞型流感病毒對金剛烷胺類藥物耐藥。綜上所述，SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株已對金剛烷胺類藥物產生耐藥性，但對神經氨酸酶抑制劑依然敏感。

2. 5 豬源H9N2亞型流感病毒致病性關鍵位點分析結果

SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株HA蛋白連接HA1和HA2的氨基酸序列均為RSSR↓GLF，僅存在2個堿性氨基酸殘基，說明這2株豬源H9N2亞型流感病毒為低致病性毒株;HA蛋白有8個保守的潛在糖基化位點，但發生P315S突變導致在313 aa處新增1個糖基化位點（NCS）;NA蛋白共有8個保守的潛在糖基化位點，未發生因NA潛在糖基化位點缺失而增強病毒致病性的情況;與參考毒株CK/SH/F/98相比，發現這2株豬源H9N2亞型流感病毒NA蛋白頸部桿狀結構在63～65 aa處并未發生缺失（表3）。在對病毒致病性產生影響的NA潛在糖基化位點中，69、86、146、200和234 aa處非常保守，但發生W402S突變，可能對神經氨酸酶活性產生影響;在內部基因中，與致病力有關的氨基酸位點與參考毒株相比均較保守，如PB2蛋白的627E和701D（陸家海等，2007），PB1蛋白的436Y、622G和709V，PA蛋白的315F和515T，NP蛋白的184K和319N?？梢姡琒W/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株為低致病性H9N2亞型流感病毒，但存在毒力變強的趨勢。

3 討論

H9N2亞型SIV致死率較低因而在實際生產中常被忽視，但從整個養殖業的發展及公共衛生意義角度出發，SIV尤其是H9N2亞型SIV的監測和防控意義重大。本研究結果表明，SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株全基因組僅M基因核苷酸序列與豬源H9N2亞型流感病毒的相似性較高，而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均與禽源H9N2亞型流感病毒的相似性較高，故推測這2株豬源H9N2亞流感病毒應是由禽源H9N2亞型流感病毒感染豬群進化產生的宿主適應性變異毒株，但以現有數據不能推斷其產生來源。這2株豬源H9N2亞型流感病毒在基因型分類上屬于G57基因型，為我國廣泛流行的H9N2亞型基因型，且與我國已報道的H7N9、H5N2和H5N1亞型流感病毒具有相似內部基因組成，說明SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株具備為多種亞型流感病毒提供內部基因的可能，與孫王楊吉等（2019）認為禽源H9N2亞型流感病毒未發生突變即能感染豬群的觀點一致，進一步佐證豬作為流感病毒進化混合器的觀點。

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（責任編輯 蘭宗寶）