云南西雙版納辣木果腐病病原鑒定

何英云 陳興全 張永科 張祖兵 徐萬壽 黃美智 張傳利 龍繼明 馬麗宣 田洋

摘要：【目的】明確辣木果腐病的病原菌種類，為該病的有效防控提供依據。【方法】采用常規組織分離法對采自云南西雙版納的辣木果腐病樣品進行病原菌分離純化;將分離物于PDA培養基上26 ℃恒溫培養，觀察其形態特征，在顯微鏡下觀察其孢子形態，初步確定其種屬;通過致病性測定、ITS序列分析等對病原菌種類進行鑒定。【結果】從感病的辣木果莢樣品中分離純化得到1株疑似致病真菌菌株YJiH-1，顯微鏡下觀察菌株YJiH-1的菌絲、單孢子、孢子囊、孢子梗和孢囊孢子等與已報道的笄霉（Choanephora spp.）高度相似。離體條件下接種菌株YJiH-1后，辣木果莢產生腐爛癥狀，并在接種發病的果莢病斑上分離到該病菌，符合柯赫氏法則。病原菌rDNA-ITS序列的BLAST同源性比對結果，菌株YJiH-1的rDNA-ITS區序列與印度巴豆瓜笄霉C.8-18菌株（登錄號KX462163）和印度CBS 178.86菌株（登錄號JN943007）的rDNA-ITS區序列完全一致（相似性100%）;與印度番木瓜瓜笄霉CP-5菌株（登錄號KX790359）的相似性為99%，進一步確定該致病菌為瓜笄霉（C. cucurbitarum）。【結論】引起云南西雙版納辣木果莢腐爛且表面有白色菌絲體的辣木果腐病病原菌為瓜笄霉（C. cucurbitarum）。

關鍵詞： 辣木;果腐病;形態特征;致病性測試;rDNA-ITS序列分析;瓜笄霉

中圖分類號： S763.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2160-07

Seed pod rot pathogen identification of Moringa oleifera in Xishuangbanna， Yunnan

HE Ying-yun1，2， CHEN Xing-quan1， ZHANG Yong-ke3， ZHANG Zu-bing3，

XU Wan-shou1， HUANG Mei-zhi1， ZHUANG Chuan-li4，

LONG Ji-ming3， MA Li-xuan5， TIAN Yang6，7*

（1 College of Plant Protection， Yunnan Agriculture University， Kunming? 650201， China; 2Horticulture Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming? 650205， China; 3 Yunnan Institute of Tropical Crops， Jinghong， Yunnan? 666100， China; 4 College of Tropical Crops， Yunnan Agricultural University， Puer，Yunnan? 665000， China; 5 Yunnan Plateau Characteristic Agriculture Industry Research Institute，Kunming? 650201， China; 6 Yunnan Provincial Key Laboratory of Biological Big Data， Kunming? 650201， China; 7College of Food Science and

Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】To identify the pathogen of seed pod rot on Moringa oleifera， and provide theory basis for effective prevention and control on the disease. 【Method】The pathogen of diseased seed pods were isolated and purified from samples collected in Xishuangbanna， Yunnan by convention tissue separation. The isolated tissues were cultured on PDA culture under 26 ℃ constant temperature， its morphological characteristics were observed. Its species and genus were preliminarily identified， and its type was identified through pathogenicity test and ITS sequence analysis results. 【Result】A suspected pathogen strain YJiH-1 was isolated and purified from the diseased seed pod of M. oleifera， which was highly identical to the morphological characteristics of hypha， monospore， sporangium， spore stem， and sporangiospore with the reported Choanephora spp. Strain YJiH-1 was inoculated to healthy seed pod of M. oleifera in vitro， and the soft and rot symptom could be observed on the inoculated seed pods. Strain YJiH-1 could be re-isolated from the di-seased seed pod which conformed to the Kochs postulates perfectly. According to BLAST homology comparison of pathogen rDNA-ITS sequence， rDNA-ITS nucleotide sequence of strain YJiH-1 shared the highest identity of 100% with the Choanephora cucurbitarum isolates of Indian croton C.8-18（accession No. KX462163） and Indian CBS 178.86（acce-ssion No. JN943007）， while it had 99% similarity with C. cucurbitarum Indian papaya isolate CP-5（accession No. KX790359）. Based on the results of morphological characteristics observation， pathogenicity test and rDNA-ITS sequence analysis of the pathogen isolated from seed pod rot on M. oleifera， the causal agent was identified as C. cucurbitarum. 【Conclusion】The pathogen causing seed pod rot of M. oleifera with white mycelium in Xishuangbanna， Yunnan is C. cucurbitarum.

Key words： Moringa oleifera; seed pod rot; morphological characteristic; pathogenicity test; rDNA-ITS sequence analysis; Choanephora cucurbitarum

Foundation item： Yunnan Key Research and Development Project（2017ZF004）; Yunnan University Science and Technology Innovation Team Support Project（Yunjiaoke〔2014〕22）; Special Project of Modern Agricultural Industry Technology System Construction（CARS-11-03A）

0 引言

【研究意義】辣木（Moringa spp.）隸屬于辣木科辣木屬，是一種多年生速生小喬木，原產于印度，19世紀引種到我國，現主要在臺灣、云南、海南和貴州等地種植（黃麗娜等，2016;夏濤等，2018）。目前報道的辣木上主要病害有果腐病、白粉病、枝條回枯病、根莖基腐病等，其中辣木果腐病是最普遍、最嚴重的病害之一。據報道，云南省辣木種植區果腐病平均發病率為4%～72%，在降水密集的7—8月果莢受害率達90%以上，嚴重時整條果莢開裂，露出種仁，種籽減產（黃美智等，2019）。引起辣木果腐病的病原較復雜，可能由多種病原菌復合侵染造成，且不同病原菌在致病性方面存在差異。因此，明確辣木果腐病病原菌種類，對辣木果腐病的防控具有重要意義。【前人研究進展】國內外對辣木的研究主要包括栽培技術、營養價值、化學成分分析、提取物功能分析等，針對辣木某一種病蟲害的深入研究較少。Kshirsagar和DSouz（1989）研究發現夏威夷內臍蠕孢[Drechslera（Cochliobolus） hawaiiensis]可侵染辣木，引起果莢腐爛;Pande和Ghate（1998）、Lezcano等（2014）研究發現半裸鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和F. solani可為害辣木果莢和幼苗莖干;Resmi等（2005）、蔣桂芝等（2007）通過致病性測定及菌絲、分生孢子形態特征觀察，將辣木果腐病的病原菌鑒定為半裸鐮刀菌（F. semitectum）;蔡志英等（2016）通過對西雙版納辣木種植區辣木果莢腐病病樣進行分離鑒定、柯赫氏驗證及致病性測定，證實蘭生炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）不僅能引起辣木果莢腐爛，同時也可侵染葉片引起葉斑;He等（2017）從辣木果腐病病樣中分離到接合菌門接合菌綱毛霉目笄霉科笄霉屬的瓜笄霉（Choanephora cucurbitarum）;黃美智等（2019）于2016—2017年對云南省7個辣木主要種植地辣木病害進行調查，明確了辣木上的常見病害種類及發生分布情況;劉一賢等（2019）采用單因子變量試驗研究了不同培養基、碳源、氮源、溫度、pH值、光照條件和致死溫度對辣木果腐病病原菌蘭生炭疽菌菌絲生長的影響，并選取10種常用殺菌劑進行了室內毒力測定。【本研究切入點】前人對不同病原菌引起的辣木果腐病進行了相關研究。本研究團隊前期調查發現，從西雙版納采集的辣木果腐病的病害癥狀與現有報道存在差異，采集病果莢表面白色菌絲體，顯微鏡下觀察其孢子囊、孢子梗和孢囊孢子均與已報道的病原菌孢子形態不同，是由何種病原菌侵染引起的病害目前尚不明確。【擬解決的關鍵問題】利用形態學特征、致病性測定、ITS序列分析等對采集自云南西雙版納的辣木果腐病樣本進行病原菌系統鑒定，以確定辣木果腐病的病原菌種類，為該病原菌引起的辣木果腐病的有效防控提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

具有典型果腐病癥狀特征的感病辣木果莢采自中—古辣木科技合作中心辣木栽培試驗示范基地（云南西雙版納），品種為印度改良辣木PKM1。培養基為馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g，用無菌水混合配制至1000 mL。供試試劑：植物基因組DNA提取試劑盒DP305和通用型DNA純化回收試劑盒（Universal DNA Purification Kit）[天根生化科技（北京）有限公司];10×Buffer、2.5 mmol/L dNTP、Taq DNA聚合酶、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株和鏈接試劑盒pMD19-T Vector Cloning Kit[寶生物工程（大連）有限公司];引物ITS1和ITS4（北京六合華大基因科技股份有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 病原菌分離及觀察 病原菌分離采用常規組織分離法（張蓉，2009）。從辣木果莢的病健交界處取約0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，用75%乙醇溶液消毒1 min后再用無菌水漂洗3次，然后置于PDA培養基上恒溫26 ℃培養2～3 d。挑取培養基中長出的單菌落進行分離純化，將分離純化獲得的代表性菌株移接到PDA培養基上，記錄菌落的生長情況，在Olympus U-UCD8 A型顯微鏡下對病原菌分生孢子進行顯微形態（孢子囊、孢囊孢子的形態和大小）觀測。參照《植物病原真菌學》（陸家云，2001）對病原菌種類進行初步鑒定。

1. 2. 2 致病性鑒定 制備孢子懸浮液，懸浮液濃度調至2.78×106個/mL。采用針刺接種法（魏林等，2009），選取6個健康、無病斑的辣木果莢，在每個果莢上選取2～3處（視果莢長短而定）進行接種。用脫脂棉蘸75%酒精少許，在辣木果莢接種部位涂拭消毒，晾干后，用滅菌解剖針蘸取孢子懸浮液輕輕地在接種部位刺10～15針，并用少量脫脂棉蘸取孢子懸浮液后包扎在傷口上。對照果莢上接種無菌水。將接種后的果莢在培養箱中[溫度26 ℃，相對濕度（80±5）%，光周期（黑暗∶光照）=12 h∶12 h]培養3 d后，觀察果莢的病害發生情況及病斑形態。待辣木果莢發病后，對感病果莢進行病原菌再分離，通過柯赫氏法則驗證病原菌。

1. 2. 3 病原菌rDNA-ITS序列的PCR擴增及系統發育分析 用植物基因組DNA提取試劑盒DP305提取代表性菌株的DNA。用通用引物ITS1和ITS4對菌株的基因組DNA進行PCR擴增，將目的片段分離純化后連接至克隆載體上并轉化大腸桿菌感受態細胞，菌液經PCR鑒定后送至昆明碩擎生物科技有限公司測序。將測序結果輸入GenBank在線網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），通過NCBI提供的BLAST工具，搜索同源性較高的序列。利用Clustal W程序將目標序列與GenBank中搜索到的相關真菌的ITS區序列進行比對，通過MEGA 6.1中的鄰位加入法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹分析親緣關系。

2 結果與分析

2. 1 辣木果腐病的發生及田間癥狀

辣木果腐病在云南主要發生于4—8月果莢快速生長期和接近成熟期，平均發病率4%～72%。高溫多雨季節或連續2～3 d的高溫多雨天氣有利于辣木果腐病的發生，嚴重時病果率高達90%，可造成種子失收。果莢感病初期病部呈淡褐色、棕褐色的點狀、條狀或不規則狀小斑（圖1-A）;感病中期，病斑擴大且多個病斑連接，甚至延伸整個果莢，果莢的顏色變深褐色，表面有一層白色菌絲體（圖1-B）;后期病害嚴重時整個果莢布滿白色菌絲體（圖1-C），果莢開裂，種子干癟（圖1-D）。

2. 2 病原菌的形態學特征

從發病的辣木果莢上分離出1株疑似致病真菌，編號為YJiH-1。菌株YJiH-1于PDA培養基上26 ℃恒溫培養1 d后產生白色至淡黃棕色菌絲（圖2-A），氣生菌絲發達;2 d后菌絲長滿整個培養皿，最外圍菌絲上面著生黑色點狀物（孢子囊）。顯微鏡下觀察，菌絲無隔膜，有分枝;孢囊梗無隔膜、不分枝、平滑透明，頂端彎曲且著生孢子囊（圖2-D）;大型孢子囊圓形，深棕色，大小50.25～77.72 μm×101.33～122.18 μm，內含多個孢囊孢子（圖2-E），孢囊孢子卵圓形、梭形，棕色或暗褐色，大小7.48～13.37 μm×47.99～69.46 μm，在兩端著生10根或10根以上纖毛（圖2-F）;小型孢子囊（單孢子的小型孢子囊）只含有1個孢子，橢圓形或卵形，棕色或暗褐色，在40倍顯微鏡下可見表面清晰的條紋，大小8.19～17.16 μm×15.55～22.84 μm（圖2-B和圖2-C）。未觀察到接合孢子。依據病原菌的培養性狀和形態學特征，初步鑒定分離物YJiH-1為毛霉目（Mucorales）笄霉科（Choanephoraceae）笄霉屬（Choanephora）的笄霉（Choa-nephora spp.）。

2. 3 病原菌致病性鑒定結果

通過針刺接種法接種的辣木果莢，接菌后第3 d果莢刺傷處出現輕度腐爛，刺傷處周圍出現明顯的水漬狀病斑（圖3-A），隨著時間的推移，水漬狀病斑不斷擴大;接種后第6 d，果莢由綠變淺褐色，表面出現白色菌絲體，果莢內輕度腐爛（圖3-B和圖3-C），病斑占據整個辣木果莢的40%左右;接種后第10～11 d，整個果莢變深褐色，嚴重腐爛，表面布滿白色菌絲體，果莢內部種子腐爛、萎縮（圖3-D和圖3-E）。空白對照無菌水接種的傷口附近均未出現任何癥狀（圖3-F）。對接種后發病的辣木果莢重新進行病原菌分離，再次獲得相同形態特征的病原菌，符合柯赫氏法則（謝聯輝，2006），證明接種用分離菌株YJiH-1為辣木果腐病病原菌。

2. 4 病原菌rDNA-ITS序列分析結果

2. 4. 1 病原菌rDNA-ITS序列的克隆與測序 以菌株YJiH-1的基因組DNA為模板，用真菌rDNA-ITS區通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，得到1條500～750 bp的條帶（圖4）。經測序，該片段全長576 bp，測序結果提交至GenBank，獲得登錄號為KY618842。

2. 4. 2 病原菌rDNA-ITS序列的BLAST比對與親緣關系分析 將菌株YJiH-1的rDNA-ITS序列在NCBI上進行BLAST同源性比對，結果表明分離所獲病原菌YJiH-1 rDNA-ITS區序列與印度巴豆瓜笄霉C.8-18菌株（登錄號KX462163）和印度CBS 178.86菌株（登錄號JN943007）的rDNA-ITS區序列完全一致（相似性100%）;與印度番木瓜瓜笄霉CP-5菌株（登錄號KX790359）的相似性為99%，進一步證實所獲得的辣木果腐病致病菌株YJiH-1為瓜笄霉（C. cucurbitarum）。

利用MEGA 6.1構建相關病原菌的系統發育進化樹，進一步分析其親緣演化關系。系統發育進化樹顯示（圖5），菌株YJiH-1與笄霉屬的C. cucurbitarum-C.8-18（登錄號KX462163）、C. cucurbitarum-CBS 178.76（登錄號JN943007）、C. cucurbitarum-CP-5（登錄號KX790359）、C. cucurbitarum-CHMcry-11（登錄號AB470640）、C. cucurbitarum-CCB001（登錄號KJ817815）、C. cucurbitarum-KA47637（登錄號KJ461159）和C. infundibulifera（登錄號KT828740）等7個分離物聚為一個獨立的分支;布拉霉屬（Blakeslea）的三孢布拉霉（B. trispora）登錄號為HQ248186和JN943005的2株菌株聚為一個獨立的分支;吉爾霉屬（Gilbertella）的桃吉爾霉（G. persicaria）登錄號為JQ951601和KT213045的2株菌株聚為一個獨立的分支;而毛霉目毛霉科毛霉屬的Mucor exponens（登錄號JN206207）則以較遠的親緣關系處在系統發育進化樹的外圍。

3 討論

本研究切取辣木病果莢病健交界處帶白色菌絲體的組織，通過病原菌分離純化、致病性測定、ITS序列分析等方法明確了引起辣木果腐病的病原菌為瓜笄霉，這是國內外繼夏威夷內臍蠕孢（Kshirsagar and DSouza，1989）、半裸鐮刀菌（Resmi et al.，2005;蔣桂芝等，2007）和蘭生炭疽菌（蔡志英等，2016）后報道的第4種引起辣木果腐病的病原。夏威夷內臍蠕孢引起辣木果莢變褐，感病部位縮小，果皮變薄;半裸鐮刀菌引起辣木果莢病斑表面出現黑色厚垣孢子堆或橙黃色孢子堆;蘭生炭疽菌導致辣木果莢呈黑色小顆粒狀物病原菌子實體。本研究結果與前人報道的辣木果腐病病原菌存在一定差異，可能與取樣部位、取樣范圍、分離鑒定方法等有關，如本研究選取的是帶白色菌絲體的辣木病果莢病健交界處組織，且大小為0.5 cm×0.5 cm;分離時只用75%乙醇溶液消毒，未用升汞溶液消毒;在室內進行柯赫氏法則驗證;鑒定過程中未對β-tubulin基因序列進行分析等。Resmi等（2005）采用致病性測定和形態學鑒定，確定引起辣木果腐病的病原菌為鐮刀菌;蔣桂芝等（2007）先用自來水沖洗果莢表面，晾干后用75%酒精表面消毒，然后削去病斑表面及周圍的皮層，選取大小為2～3 mm×2～3 mm的組織進行接種，最終根據菌絲和分生孢子形態，將病原菌鑒定為半裸鐮刀菌;蔡志英等（2016）選取受害果莢中有黑色小顆粒狀物的病原菌子實體進行分離培養、顯微觀察，并結合多基因分析的方法，將分離出的炭疽病菌鑒定為蘭生炭疽菌。

瓜笄霉侵染植物體的速度非常快，在溫濕度較適宜的情況下，2～3 d即可表現癥狀。瓜笄霉主要侵染植物的葉、花和果實，引起花和果實等腐爛，可被侵染的寄主種類豐富，如尼日利亞的莧菜（Adebanjo，1994）、日本的冰葉日中花（Kagiwada et al.，2010）、山東的瓜類（李金堂，2011）、韓國的秋葵（Park et al.，2015）、印度的花椰菜（Gogoi et al.，2016）和巴西的豬屎豆（Alfenas et al.，2018）等。在印度，瓜笄霉較常見，而辣木原產于印度，因此瓜笄霉極有可能是通過辣木種子帶菌傳入我國。目前，國內報道的瓜笄霉主要在山東壽光引起瓜類的花腐和幼果腐爛，4—5月和8—10月是瓜笄霉褐腐病高峰期，造成瓜類大面積死亡。

辣木果腐病主要發生在5—8月辣木快速生長期和接近成熟期，此時正是西雙版納的雨季，高溫、高濕的自然條件非常有利于該病的流行。目前，僅在云南西雙版納地區辣木果腐病就有2種病原菌，且不同病原菌引起辣木果腐病的癥狀也不同，表明辣木果腐病可能存在多種病原菌。本研究團隊在西雙版納辣木種植基地只發現了瓜笄霉1種病原菌，并未發現現有報道的其他病原菌，這些病原菌是否存在協同侵染有待進一步驗證。

4 結論

通過病原菌形態學和分子生物學鑒定，確認引起云南西雙版納辣木果莢腐爛且表面有白色菌絲體的辣木果腐病病原菌為瓜笄霉（C. cucurbitarum）。

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（責任編輯 麻小燕）